———————————————————————-Page10910-1810/08/\100/頁/JCLS生体観察できるようになり,研究のみならず臨床にも応用されてきた1,2).筆者らはこれまでに,白色光(ハロゲンランプ)を光源とする生体共焦点角膜顕微鏡(Con-foscanR2,NIDEK社)を用いた角膜研究を行ってきた310).近年,レーザーを光源とする生体共焦点角膜顕微鏡(HRTIIロストック角膜モジュール,ハイデルベルグ社,ドイツ)が開発され,より高解像度の角膜・結膜の生体画像が得られるようになった11,12).本稿では,筆者らがこれまでに生体共焦点顕微鏡を使用して行った研究を中心に概観し,本装置の臨床的有用性について紹介する.I生体共焦点角膜顕微鏡の特徴コンフォスキャンR2は白色光(ハロゲンランプ)を光源とし,2枚のスリットが同期して作動する走査型生体共焦点顕微鏡である.約330×440μmの画像サイズでの角膜全層における前額断面画像を得ることができる.やや厚めの光学切片(被写界深度10μm)として観察されるため,解像度では後述するHRTIIロストック角膜モジュールに劣るが,実質内の神経の走行や内皮の描出能が優れている.一方,HRTIIロストック角膜モジュールでは光源として単一波長670nmのダイオードレーザーを用いているため散乱光が少なく,より鮮明で解像度の高い細胞レベルでの断面像を得ることが可能となった.その結果,角膜のみならず,結膜やマイボーム腺の観察も可能となった13).得られる画像のサイズは約400×400μmであり,薄い光学切片(被写界深度4μm)での観察が可能である14).はじめに共焦点顕微鏡は,厚みのある試料中の特定の面に焦点を合わせ,同時に焦点の合っていない上下の面からの余分な反射光を除外することで,一定の焦点面のみのコントラスト比の高い鮮明な画像を得ることができる.共焦点顕微鏡の角膜への応用は1990年代から始められ,角膜を構成する細胞層や神経線維が前額断面で非侵襲的に(45)1373ArKoys研究顕9208641131研究たい25(10):13731380,2008c第5回日本角膜学会学術奨励賞受賞記念講演生体共焦点顕微鏡を用いた角膜疾患の研究InVivoConfocalMicroscopyofCornea小林顕*総説共焦点顕微鏡の角膜への応用は1990年代から始められ,角膜を構成する細胞層や神経線維を短時間で非侵襲的に,しかもくり返して生体観察(invivobiopsy)することが可能となった.筆者らはこれまでに,白色光を光源とするスリット走査型生体共焦点顕微鏡を使用し,粉状角膜(corneafarinata),フランコイス(Francois)角膜ジストロフィなど,病理組織学的報告がきわめて少ない疾患を解析し,特徴的な生体病理組織所見を報告してきた.近年,波長670nmのダイオードレーザーを光源とする角膜専用生体レーザー共焦点顕微鏡が開発され,解像度の高い生体角膜前額断画像が得られるようになった.筆者らは,本装置を用いて正常ボウマン層,シールベンケ/ライスビュックラーボウマン層ジストロフィ,アベリノ/格子状/斑状角膜実質ジストロフィなどの生体病理組織所見について報告してきた.また,本装置は現在急増中のアカントアメーバ角膜炎の迅速診断において非常に有用であるなど,前眼部疾患の診断や治療効果を判定する補助手段に,あるいは眼表面疾患の自然経過などを観察する検査機器として有用であると思われる.キーワード:生体共焦点顕微鏡,invivobiopsy,角膜,ボウマン層,アカントアメーバ角膜炎,角膜ジストロフィ.要約———————————————————————-Page21374あたらしい眼科Vol.25,No.10,2008(46)II粉状角膜(corneafarinata)粉状角膜は角膜実質深層に微細な混濁を認める両眼性の稀な病態で,加齢性の変化と考えられている.通常視力低下をきたさないため,眼科受診時に偶然に発見されることが多い.粉状角膜に関する唯一の病理組織学的報告では,角膜実質に脂肪滴様の封入物を含む異常なケラトサイトを認めたという15).コンフォスキャンR2を用いた生体観察では,角膜実質深層のデスメ膜近傍のケラトサイト細胞質内に高輝度の小顆粒を全例に認め,病理組織学的報告と対応する所見が得られた(図1)4).IIIフランコイス角膜ジストロフィ(centralcloudydystrophyofFrancois)フランコイス角膜ジストロフィは,両眼の角膜中央部実質深層のレベルで,透明ラインに仕切られたモザイク状の淡い混濁をきたす非進行性の角膜ジストロフィ(図2A)で,1955年にJ.Francoisにより最初に報告された16).常染色体優性遺伝とされているが,孤発例もみられ,原因遺伝子は同定されていない.角膜上皮や内皮機能は正常である.通常視力障害はきたさないため,眼科受診時に偶然発見されることが多い.病理組織学的には,実質深層のコラーゲンラメラの波打ち状の変化や,上皮基底層・デスメ膜近傍への酸性ムコ多糖類の沈着が報告されている17).コンフォスキャンR2を用いた生体観察では,実質浅層とデスメ膜近傍の高輝度点状沈着物と,実質最深部の高輝度の背景の中に,低輝度のストリエを多数認め(図2B),これまでの病理組織所見と対応する生体組織所見が得られた5).IVボウマン層ジストロフィ1.シールベンケ角膜ジストロフィシールベンケ角膜ジストロフィは,1967年にThielとBehnkeにより,小児期から角膜上皮びらんをくり返す,ボウマン層レベルの蜂巣状角膜混濁をきたす角膜ジストロフィとして報告された疾患である(図3A)18).電子顕微鏡で角膜上皮下にcurlyberがみられるのが特徴とされる.ボウマン層ジストロフィの一つとして,CDB2型(cornealdystrophyofBowman’slayerandtheanteriorstroma,type2)として分類されている19).図1粉状角膜患者角膜のコンフォスキャンR2による観察実質深層のケラトサイト細胞質内に顆粒状高輝度物質の沈着を認めた(矢印).画像サイズ330×440μm.図2フランコイス角膜ジストロフィA:前眼部所見.透明ラインに仕切られたモザイク状の混濁を角膜中央部実質深層に認めた.B:A症例のコンフォスキャンR2による角膜生態観察所見.実質最深部のレベルにおいて,高輝度の背景の中に,低輝度のストリエを多数認めた.画像サイズ330×440μm.AB———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25,No.10,20081375(47)Transforminggrowthfactorbeta-induced遺伝子(TGFBI)のR555Q変異で本ジストロフィが生じる.生体レーザー共焦点顕微鏡では,上皮基底層とボウマン層レベルに,低輝度のハローを伴う中輝度・非顆粒状陰影を認めた(図3B,C)20).2.ライスビュックラー角膜ジストロフィ(表在型顆粒状角膜ジストロフィ)TGFBI遺伝子のR124L変異で生じる稀な常染色体優性の角膜ボウマン層ジストロフィ(CDB1型)で,5歳頃から再発性の角膜びらんを生じ,地図状に細かい角膜混濁をきたす(図4A)2125).病理組織所見では,アミロイドの沈着はみられず,顆粒状角膜ジストロフィでみられるマッソン(Masson)トリクロム染色で赤色に染まるヒアリン様物質が上皮下に強くみられる.電子顕微鏡では,角膜上皮下にrodshapedbodyがみられるのが特徴とされる.生体レーザー共焦点顕微鏡所見は前述したシールベンケ角膜ジストロフィとまったく異なり,上皮基底層とボウマン層レベルに,ハローを伴わない高輝度・顆粒状陰影を認め,鑑別診断の際に参考となる(図4B,C)20).V角膜実質ジストロフィ1.アベリノ角膜ジストロフィアベリノ角膜ジストロフィは顆粒状角膜ジストロフィと格子状角膜ジストロフィの両者の特徴を有する角膜実質ジストロフィとして,1992年に提唱された疾患で,顆粒状の角膜混濁とともに,実質中層に白色の線状,星状,刺状,雪の結晶状の混濁など,多彩な角膜所見を認める(図5A)26).この常染色体優性の角膜ジストロフィはTGFBI遺伝子のR124H変異によって生じる.生体ABC4ライスビュックラー角膜ジストロフィ(TGFBIR124Lヘテロ遺伝子変異)A:前眼部写真.ボウマン層のレベルに,地図状角膜混濁を認めた.B:レーザー共焦点顕微鏡による生体観察では,上皮基底層とボウマン層レベルに,ハローを伴わない高輝度・顆粒状陰影を認めた.C:ボウマン層は高輝度陰影を示す沈着物で置換されていた.画像サイズ400×400μm.ABC3シールベンケ角膜ジストロフィ(TGFBIR555Qヘテロ遺伝子変異)A:前眼部写真.ボウマン層のレベルに,蜂巣状角膜混濁を認めた.B:レーザー共焦点顕微鏡による生体観察では,上皮基底層とボウマン層レベルに,低輝度のハローを伴う中輝度・非顆粒状陰影を認めた.C:ボウマン層は中輝度陰影を示す沈着物で置換されていた.画像サイズ400×400μm.———————————————————————-Page41376あたらしい眼科Vol.25,No.10,2008(48)レーザー共焦点顕微鏡では,病理組織に対応したさまざまな大きさの,辺縁不整な高輝度陰影が実質に散在して認められる(図5B)27).2.格子状角膜ジストロフィ格子状角膜ジストロフィは角膜実質に半透明の線状または糸状の混濁が生じる遺伝性疾患であり,原因遺伝子の違いによりいくつかのサブタイプが知られている.格子状角膜ジストロフィの多くはⅠ型であり,TGFBIR124C変異が原因とされている(図5C)28).レーザー共焦点顕微鏡では,実質浅層・中層に枝分かれした線状・糸状・サンゴ礁様の高輝度陰影が認められ,病理組織所見との対応が確認された(図5D)27).3.斑状角膜ジストロフィ斑状角膜ジストロフィは常染色体劣性の遺伝性疾患であり,角膜実質全層の多発性斑状混濁とびまん性混濁を特徴とする疾患である(図5E).硫酸転移酵素(carbo-hydratesulfotransferase6:CHST6)の遺伝子変異により生じる29).レーザー共焦点顕微鏡では,実質は均一に高輝度を呈しており,低輝度のストリエ様陰影を同時に認めた(図5F)27).AB5A,Bアベリノ角膜ジストロフィ(TGFBIR124H)A:前眼部所見.さまざまな大きさの,辺縁不整な高輝度陰影が実質に散在して認められた.B:生体レーザー共焦点顕微鏡では,病理組織に対応したさまざまな大きさの,辺縁不整な高輝度陰影が実質に散在して認められた.画像サイズ400×400μm.CD5C,D格子状角膜ジストロフィ(TGFBIR124C)C:前眼部所見.角膜中央部の実質混濁と半透明の線状または糸状の混濁を認めた.D:レーザー共焦点顕微鏡では,実質浅層・中層に枝分かれした線状・糸状・サンゴ礁様の高輝度陰影が認められた.画像サイズ400×400μm.EF5E,F斑状角膜ジストロフィ(CHST6A217T)E:前眼部所見.角膜実質全層の多発性斑状混濁とびまん性混濁を認めた.F:レーザー共焦点顕微鏡では,実質は均一に高輝度を呈しており,低輝度のストリエ様陰影も同時に認めた.画像サイズ400×400μm.———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.25,No.10,20081377(49)VIアカントアメーバ角膜炎アカントアメーバ角膜炎はコンタクトレンズ装用者に多くみられる難治性の角膜炎であり(図6A)3032),近年若年者を中心に大変な増加傾向が認められる.本症はしばしばヘルペスと誤診され,抗生物質やゾビラックス,ステロイドなどの治療に抵抗するためいくつかの眼科を転医し,経過が長いことが多い.発症初期での診断・治療開始は視力予後に関係するため,早期発見が何より重要である.生体共焦点顕微鏡の最大の眼科臨床的価値は,アカントアメーバ角膜炎の迅速初期診断にあると考えている33).レーザー生体共焦点顕微鏡を用いることにより,アカントアメーバのシストは直径1020μmの円形高輝度物質として上皮内に観察される(図6B).従来は,アカントアメーバの疑いが濃厚である場合に初めて上皮の掻破,鏡検などの侵襲的な検査を行っており,早期診断の機会を逃す場合もみられた.その点,生体共焦点顕微鏡は非侵襲的な検査であるため,本症の疑い例には躊躇なくただちに施行できる利点がある.筆者らは,角膜内におけるアメーバシストの観察(invivoobservation)に加えて,アメーバ生食培地で培養したアメーバシストもレーザー共焦点顕微鏡で観察(exvivoobservation)した.その結果,生体の角膜上皮内では円形に観察されることが多いシストが,培養液中ではより自然な金平糖状の形態をしておりクラスターを形成する傾向にあることを報告した(図6C).VIIKstructureの発見ボウマン層と角膜実質の境界面領域には,角膜上皮下神経より若干輝度の低い線維状の不定形構造物が認められ(図7),網目状のネットワークを形成しているように思われる.この構造物は上皮下神経叢よりわずかに実質側に位置しており,幅は515μm程度である.本構造物は,筆者らが調べたすべての健常人(男性10人,女性9人,平均年齢46.2±21.7歳,1877歳)において観察され,角膜中央部と同様に,周辺部角膜でも確認できた34).従来の白色光源生体共焦点顕微鏡(コンフォスABC62週間交換ソフトコンタクトレンズ使用中の19歳男性の初診時A:前眼部写真.上皮下混濁と多くの放射状角膜神経炎を認めた.B:レーザー共焦点顕微鏡による観察では,上皮基底層のレベルに,円形(直径1020μm)で高輝度の物質を多数確認でき,アカントアメーバのシストと思われた.画像サイズ400×400μm.C:アカントアメーバシストのexvivoレーザー共焦点顕微鏡所見.同一症例の角膜より得られた検体をアメーバ培地で培養し,レーザー共焦点顕微鏡で観察した.シストはクラスターを形成し,直径1020μmの高輝度星状物質(stel-late-shapedparticles)として観察された.画像サイズ400×400μm.図7ボウマン層と角膜実質の境界面領域に観察された角膜実質のコラーゲン線維の終末部と考えられる構造(白矢印)(K-structure)黒矢印は上皮下神経を示す.———————————————————————-Page61378あたらしい眼科Vol.25,No.10,2008(50)キャンR2)では同定が不可能であり,レーザー生体共焦点顕微鏡にて初めて可視化に成功した.これまでに報告のない構造物のため,筆者らはKobayashi-structure(K-structure)と命名した34).また,顕微鏡先端部のカバー(トモキャップR)を用いて角膜に軽く圧迫を加えながら角膜を観察することにより,本構造物に一致した隆起(ridge)を角膜上皮基底層レベルにおいて確認できる.この隆起は,直下に観察されるK-structureの方向に完全に一致しており,K-structureとの強い関連性が示唆された.過去において,TripathiとBronらは,角膜を圧迫する際(ゴールドマン眼圧計などでの圧平時)に角膜上皮基底層レベルにおいて観察される隆起と角膜フルオレセインモザイク(フルオレセイン存在下で眼瞼の上から角膜を軽くマッサージすると出現する)との関係に興味をもち,角膜実質表層コラーゲン線維がボウマン層実質側に融合しているという解剖学的な構造が角膜フルオレセインモザイクの発生原因であると結論した35).これら過去の報告やK-structureの解剖学的な位置などから,本構造物は角膜実質コラーゲン線維終末部の前額断面の所見であると推測した34).なお,K-struc-tureはボウマン層ジストロフィ(シールベンケ角膜ジストロフィ,ライスビュックラース角膜ジストロフィ)においては消失していた20).さらに,角膜屈折矯正手術後において,ボウマン層が温存されるlaserinsituker-atomileusis後にはK-strucrureは観察されるが,ボウマン層が破壊されるepipolislaserinsitukeratomileu-sis後にはK-structureは消失していた(unpublishedobservation).また,ボウマン層が存在しないとされるブタやウサギ角膜を本装置で観察したところ,K-struc-tureは確認できなかった(unpublishedobservation).これらの事実は,ボウマン層とK-structureの強い関連性を示唆する所見であり,K-structureはボウマン層の健常性の指標として有用かもしれない.なお,K-struc-tureの広範囲マッピングを使用した最近の筆者らの研究では,K-structureは角膜フルオレセインモザイク発生の解剖学的原因であることが強く示唆されるデータを得ている36).おわりに生体共焦点顕微鏡を用いることにより,短時間で非侵襲的に,しかもくり返して経時的な角結膜の生体観察(invivobiopsy)を行うことが可能となった.コンフォスキャンでは,光学切片が厚いため,実質内の神経の走行や内皮の描出に適している.一方,HRTIIロストック角膜モジュールは高解像度であり,より詳細な細胞レベルの画像が得られるようになった.その結果,本稿で述べたような,これまでに報告のない構造物を可視化することに成功した.また臨床面においては,現在急増中のアカントアメーバ角膜炎の迅速診断において非常に有用であるなど,前眼部疾患の診断や治療効果を判定する補助手段に,あるいは眼表面疾患の自然経過などを観察する検査機器として有用であると思われる.画像解像度のさらなる上昇や,広範囲スキャンを可能にするソフトウェアの開発,3次元画像の作成を容易にするソフトウェアの搭載など,今後の発展が期待される.謝辞:稿を終えるにあたり,受賞講演の機会を与えてくださいました学術奨励賞選考委員各位,角膜学会理事長西田輝夫教授,第32回日本角膜学会会長天野史郎准教授に心より感謝申し上げます.また,研究のご指導を賜りました金沢大学医薬保健研究域医学系視覚科学の杉山和久教授,研究に協力していただいた金沢大学医薬保健研究域医学系視覚科学の横川英明先生,吉田都是先生,井尻茂之先生と外来スタッフに深謝いたします.文献1)CavanaghHD,PetrollWM,AlizadehHetal:Clinicalanddiagnosticuseofinvivoconfocalmicroscopyinpatientswithcornealdisease.Ophthalmology100:1444-1454,19932)KaufmanSC,MuschDC,BelinMWetal:Confocalmicroscopy:areportbytheAmericanAcademyofOph-thalmology.Ophthalmology111:396-406,20043)KobayashiA,SugiyamaK:InvivocornealconfocalmicroscopicndingsofpalisadesofVogtanditsunderly-inglimbalstroma.Cornea24:435-437,20054)KobayashiA,OhkuboS,TagawaSetal:Invivoconfocalmicroscopyinthepatientwithcorneafarinata.Cornea22:578-581,20035)KobayashiA,SugiyamaK,HuangAJ:InvivoconfocalmicroscopyinpatientswithcentralcloudydystrophyofFrancois.ArchOphthalmol122:1676-1679,20046)KobayashiA,MaedaA,SugiyamaK:In-vivoconfocalmicroscopyintheacutephaseofcornealinammation.OphthalmicSurgLasersImaging34:433-436,20037)KobayashiA,SakuraiM,ShiraoYetal:In-vivoconfocalmicroscopyandgenotypingofafamilywithThiel-Behnke(Honeycomb)cornealdystrophy.ArchOphthalmol121:1498-1499,20038)KobayashiA,YoshitaT,SugiyamaK:White-lightandlaserconfocalmicroscopicndingsofrabbitconjunctiva.OphthalmicSurgLasersImaging35:146-148,20049)KobayashiA,YoshitaT,SugiyamaK:Invivolaserandwhite-lightconfocalmicroscopicndingsofhumancon-junctiva.OphthalmicSurgLasersImaging35:482-484,2004———————————————————————-Page7あたらしい眼科Vol.25,No.10,20081379(51)10)KobayashiA,SugiyamaK:Invivoconfocalmicroscopyinapatientwithkeratopigmentation(cornealtatooing).Cornea24:238-240,200511)StaveJ,ZinserG,GrummerGetal:ModiedHeidelbergRetinalTomographHRT.Initialresultsofinvivopresen-tationofcornealstructures.[DermodizierteHeidelberg-Retina-TomographHRT.Ersteergebnisseeinerin-vivo-darstellungvonkornealenstrukturen]Ophthalmologe99:276-280,200212)ZhivovA,StachsO,KraakRetal:Invivoconfocalmicroscopyoftheocularsurface.TheOcularSurface4:81-93,200613)KobayashiA,YoshitaT,SugiyamaK:Invivondingsofbulbar/palpebralconjunctivaandpresumedmeibomianglandbylaserscanningconfocalmicroscopy.Cornea24:985-988,200514)HeidelbergRetinaTomograph2(RostockCorneaModule)OperatingInstructionsofSoftwareVersion1.1.Dossen-heim,Germany,200415)DurandL,BouvierR,BurillonCetal:Corneafarinata.Reportofacase:clinical,histologicandultrastructuralstudy.JFrOphtalmol13:449-455,199016)F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