あたらしい眼科

———————————————————————-Page1（91）2290910-1810/09/\100/頁/JCLS47回日本白内障学会原著》あたらしい眼科26（2）：229234，2009cはじめにさまざまな病態の発症進展の要因として過酸化反応（オキシデーション）の関与が明らかになるにつれ，その防御策として抗酸化物質への期待が高まっている．眼科領域においても例外ではなく，白内障や糖尿病網膜症，ぶどう膜炎や加齢黄斑変性（age-relatedmaculardegeneration：AMD）など種々の病態に対し，抗酸化剤が期待されている1）．われわれが日常，経口的に摂取する天然抗酸化物質としては，ビタミンAの前駆体であるカロテノイド，ビタミンC，ビタミンEがあげられるが，近年，カロテノイドの一種であるアスタキサンチン（astaxanthin：AX）が，その強力な抗酸化作用や天然抗酸化物質としての安全性から注目され，多方面からの研究が進められている2）（図1）．筆者らも，AXに関し現在研究を進めているが，第46回日本白内障学会総会において，AXが白内障手術後の抗炎症効果として有用であったことを報告している3）．〔別刷請求先〕橋本浩隆：〒305-0021つくば市古来530つくば橋本眼科Reprintrequests：HirotakaHashimoto,M.D.,TsukubaHashimotoOpticalClinic,530Furuku,Tsukuba-shi305-0021,JAPANアスタキサンチンによる房水中Superoxide消去活性への影響橋本浩隆＊1,2新井清美＊2高橋二郎＊3筑田眞＊2小原喜隆＊4＊1つくば橋本眼科＊2獨協医科大学越谷病院眼科＊3富士化学工業株式会社＊4国際医療福祉大学視機能療法学科EectofAstaxanthinConsumptiononSuperoxideScavengingActivityinAqueousHumorHirotakaHashimoto1,2）,KiyomiArai2）,JiroTakahashi3）,MakotoChikuda2）andYoshitakaObara4）1）TsukubaHashimotoOpticalClinic,2）DepartmentofOphthalmology,KoshigayaHospital,DokkyoUniversitySchoolofMedicine,3）FujiChemicalIndustryCo.,LTD.,4）DepartmentofOrthopticsandVisualSciences,InternationalUniversityofHealthandWelfareアスタキサンチン（AX）摂取によるsuperoxide消去活性（O2・活性）への影響をヒト房水から検討した．対象は両眼の白内障手術を施行した35例であり，両眼の手術をAX摂取（2週間，6mg/日）前後で行い，術中採取した房水からニトロブルーテトラゾリウム（NBT）還元法でO2・活性（U/ml）を測定した．糖尿病（DM）の有無で非DM群19例とDM群16例に分類し，O2・活性，変化率（％），性差から比較した．AX摂取前後のO2・活性は，DM群が摂取後で有意に上昇した．変化率もDM群で大きい傾向があった．性差では，非DM群のAX摂取前後の比較で，O2・活性は有意に男性の摂取後で上昇した．AX摂取前値のO2・活性の男女比較では，有意に男性が低値であった．DM群のO2・活性は，有意に男性の摂取後で上昇した．変化率では，非DM群の男性で有意に変化率が高かった．糖尿病者では低下していたO2・活性がAX摂取で正常人レベルに上昇した可能性があり，特に男性がより有効であった．Weexaminedtheeectofastaxanthin（AX）consumptiononsuperoxide-scavengingactivity（O2・activity）inaqueoushumor.Thesubjectscomprised35patientswhowerescheduledforcataractsurgeryonbotheyes.Sur-geryononeeyewasperformedbeforeAXconsumption（for2weeks,6mg/day）；surgeryontheothereyewasperformedafterAXconsumption,andO2・activity（U/ml）wasmeasured.Basedonthepresenceofdiabetes（DM）,thesubjectswereclassiedintotwogroups,thenon-DMgroupandtheDMgroup；O2・activityandrateofchange（％）werecomparedbetweenthegroupsbysex.O2・activitywassignicantlyincreasedbyAXconsump-tionintheDMgroup.Regardingdierencesbysex,O2・activitybeforeAXconsumptionwassignicantlylowerinmalesandincreasedsignicantlyafterAXconsumptioninmales.Therateofchangewassignicantlyhighformalesinthenon-DMgroup.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）26（2）：229234,2009〕Keywords：アスタキサンチン，房水，スーパーオキサイド，抗酸化，活性酸素．astaxanthin,aqueoushumor,superoxide,antioxidant,activeoxygen.———————————————————————-Page2230あたらしい眼科Vol.26，No.2，2009（92）眼疾患においては，カロテノイドの一種であるルテインがサプリメントとしてAMDに対し有効とされ広く推奨されている3,4）が，AXも眼内における抗酸化作用が明らかとなれば，白内障をはじめとしてオキシデーションが関連した種々の疾患に有用な物質として認識される可能性がある．今回筆者らは，AX摂取による眼内への影響について，ヒト房水中のsuperoxide消去活性の変化から検討を行うこととした．I対象および方法1.対象対象は，つくば橋本眼科にて両眼の白内障手術を施行した35例である．ぶどう膜炎など，炎症をきたしやすい疾患を有する例や8ジオプトリー以上の高度な屈折以上を有する例，核の硬化が著しい例，散瞳が不良な例，手術に難渋が予想された例，また，他のサプリメントを摂取している者は除外した．AXの摂取にあたっては，対象者に研究の趣旨をよく説明し，本人の同意を得て研究を行った．研究のためAXの摂取が必要である期間中において，何らかの理由により摂取継続を希望しない例は，速やかに摂取を中止することとし対象外とした．糖尿病者は過酸化反応が進行しやすいことから，対象者を糖尿病の有無で分類し，非糖尿病群（以下，非DM群と略）19例と，糖尿病群（以下，DM群と略）16例の2群に分けて比較検討した．平均年齢は，非DM群71.5±7.6歳，DM群70.3±6.2歳であり両群に差はなかった．2.方法両眼の白内障手術を行うにあたり，1眼目の手術の直後からAX摂取を開始し，2週間後に2眼目の手術を施行した．各々の手術において術中に1次房水を採取し，採取液（房水）を速やかに窒素ガス充のうえ，40℃で測定までの間冷凍保存した．その採取液から，ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）還元法でsuperoxide消去活性の測定を行った5）．試薬は，和光純薬のSODテストワコーRを用いた．今回用いたこの方法では，superoxidedismutase（SOD）のほか，還元型グルタチオン（GSH：glutathione）やL-アスコルビン酸などSOD以外のsuperoxide消去物質の活性も含めたtotalのsuperoxide消去活性を測定している．得られたデータを解析し，非DM群とDM群の2群で，消去活性値，変化率，性差から比較検討を行った．AX摂取前後のsuperoxide消去活性の変化率は，以下の式を用いて算出した．AX摂取前後のsuperoxide消去活性の変化率（％）＝（摂取後のsuperoxide消去活性摂取前のsuperoxide消去活性）/摂取後のsuperoxide消去活性×100データの解析には，Mann-WhitneyのU検定とWilcoxonの符号付順位和検定を，比較する対象に応じて用いた．AXの摂取量は6mg/日であり，1眼目の手術当日から2眼目の手術までの間，毎日継続して摂取した．AXの摂取には，市販品サプリメントであるアスタビータR（富士化学工業株式会社製）を用いた．II結果（図26）1.DMの有無での比較1）AX摂取とsuperoxide消去活性値の関係は，非DM群で摂取前18.8±3.1U/ml，摂取後19.7±2.5U/ml，DM群で摂取前17.5±5.1U/ml，摂取後20.1±4.7U/mlであり，両群ともに摂取後にsuperoxide消去活性が高くなったが，特にDM群では有意（p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定）に上昇した（図2）．2）AX摂取前後の変化率は，非DM群で3.6±18.3％，DMHOOHOO図1アスタキサンチンの構造式変化率（％）806040200－20－40非DM群（n＝19）DM群（n＝16）図3AX摂取によるsuperoxide消去活性の変化率消去活性摂取摂取＝19）：DM群（n＝16）＊＊：p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定図2AX摂取とsuperoxide消去活性の関係———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.26，No.2，2009231（93）群で12.0±20.6％であり，DM群で変化率は高い傾向があったが，両群間で有意差はなかった（図3）．2.男女の比較1）性差による比較では，非DM群でsuperoxide消去活性値をAX摂取前後で比べると，男性はAX摂取前16.9±1.7U/ml，AX摂取後20.0±1.4U/ml，女性ではAX摂取前20.0±3.3U/ml，AX摂取後19.6±3.0U/mlであり，AX摂取後において有意（p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定）に男性が上昇した．AX摂取前値においては，男女比較で，有意（p＜0.05，Mann-WhitneyのU検定）に男性が低値であった（図4-a）．DM群の男性はAX摂取前16.7±5.2U/ml，AX摂取後20.0±5.0U/ml，女性はAX摂取前18.7±5.3U/ml，AX摂取後20.2±5.2U/mlであり，男性の摂取前後で有意（p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定）に上昇した．DM群ではAX摂取前後で男女差はなかった（図4-b）．2）変化率では，非DM群で男性15.2±9.1％，女性3.2±19.2％，DM群で男性16.1±20.7％，女性6.8±20.6％であり，両群ともに男性で変化率が高くなっていた．特に，非DM群では値にばらつきも少なく，男性で有意（p＜0.05，Mann-WhitneyのU検定）に変化率が高くみられた（図5）．3）全体的に性差の影響を検討するため，非DM群とDMSuperoxide消去活性値（U/ml）262422201816141210摂取前a.非DM群b.DM群2週間摂取後：非DM群男性（n＝7）：非DM群女性（n＝12）＊＊＊＊：p＜0.05，Mann-WhitneyUtest＊＊：p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定Superoxide消去活性値（U/m?）262422201816141210摂取前2週間摂取後：DM群男性（n＝9）：DM群女性（n＝7）＊＊：p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定図4AX摂取とsuperoxide消去活性の関係（男女比較）＊a.非DM群b.DM群＊：p＜0.05，Mann-WhitneyUtest変化率（％）806040200－20－40男性（n＝7）女性（n＝12）変化率（％）806040200－20－40男性（n＝9）女性（n＝7）図5AX摂取によるsuperoxide消去活性の変化率（男女比較）Superoxide消去活性値（U/ml）262422201816141210摂取前2週間摂取後：総男性群（n＝16）：総女性群（n＝19）＊＊＊＊：p＜0.05，Mann-WhitneyUtest＊＊：p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定図6AX摂取とsuperoxide消去活性の関係（総男女比較）———————————————————————-Page4232あたらしい眼科Vol.26，No.2，2009（94）群を合わせて（非DM＋DM）総男性群と総女性群として検討すると，総男性群で摂取前16.8±3.9U/ml，摂取後20.0±3.5U/ml，総女性群で摂取前19.5±4.0U/ml，摂取後19.8±3.8U/mlであり，総男性群においてAX摂取前後で有意（p＜0.05，Wilcoxonの符号付順位和検定）な上昇がみられ，AX摂取前値において総男性群と総女性群の間に有意（p＜0.05，Mann-WhitneyのU検定）な差がみられた（図6）．III考按好気性生物には，活性酸素・フリーラジカルによる酸化的障害を防御する抗酸化物質機構として，その産生を抑制する予防的抗酸化物（preventiveantioxidant）と，生成された活性酸素・ラジカルを捕捉する連鎖切断型抗酸化剤（chain-breakingantioxidant）がある．前者にはSOD，カタラーゼ，グルタチオンリダクターゼ，グルタチオンペルオキシダーゼ（glutathioneperoxidase：Gpx）などの酵素類があり，後者には水溶性のL-アスコルビン酸など還元糖，GSH，尿酸，ビリルビン，脂溶性のビタミンE，ユビキノール，カロテノイド類があげられる．また，カテキンなどポリフェノール類のなかには，水溶性・脂溶性双方に親和性をもつ両親媒性の抗酸化物質も知られている．脂溶性の抗酸化剤は脂質膜内で脂質ペルオキシラジカルを捕捉してラジカル連鎖反応を停止する作用をもっている6）．カロテノイドは主として炭素数40個からなる一種のテルペノイド色素であり，カロテン類とキサントフィル類に大別される．キサントフィル類の代表例として，高等植物や藻類の光合成色素として重要なルテインやフコキサンチン，魚介類の体表などに広く分布するAX，ツナキサンチン，ゼアキサンチンなどがあげられる2）．カロテノイドは，植物や微生物によってのみ合成され，動物は生合成することができないため，食餌などの方法により体内に取り込み，代謝・蓄積をして抗酸化剤として役立てている．AXは，エビ，カニなどの甲殻類，サケ，タイなど魚類に広く分布する赤橙色の色素であり，1937年にKuhnとSoe-rensenによりロブスターから初めて分離された物質7）である（図1）．AXは，強力な抗酸化作用があることが報告されており，その活性の強さはビタミンEの約1,000倍，b-カロテンの約40倍とされている8,9）．AXは近年注目されているものの，存在自体は古くから知られており，色素として食品添加物への使用実績が長く，そして，食品として通常に摂取していることからその安全性は高く評価されている物質である10,11）．活性酸素・フリーラジカルによる障害の生体内標的分子としては脂質，核酸，蛋白質などが重要であるが，なかでも脂質が活性酸素の作用を受けやすい．特に生体膜の脂質中に局在する高度不飽和脂肪酸がそのターゲットとなりやすく，脂質過酸化連鎖反応を介して過酸化脂質を生成する．生体膜の脂質過酸化反応は膜構造の破壊だけでなく，機能も障害を被ることになる．図7は，AXの活性酸素種に対する消去効果として，今回の結果をふまえて，現段階で筆者らが考えている各活性酸素の生成と消去機構についての経路の模式図である．非水系内では，幹らによると，invitroの実験でAXは，一重項酸素消去と過酸化脂質への抑制効果は大きいが，superoxideの消去作用は弱いことが報告されている2）．非水系内ではAXは蛋白質と結合していないfreeタイプで存在していると考えられており，この「freeタイプのAX」は脂溶性で，膜などおもに脂質richな部位で抗酸化に機能していると考えられる．一方，水系内ではAXは蛋白質あるいはアミノ酸などと結合して存在している可能性が高いと考えられ，AXの輸送と代謝にはリポ蛋白質などが関与していると推察されている．今回筆者らが測定を行った房水中でも，AXは蛋白質結合型で存在している可能性が高いと考えられるが，この蛋白質と結合した「蛋白質結合型のAX」の水溶液中での生体への影響については，近年，各方面で検討が始まったばかりである．また，invivoのAX摂取後の水系内での影響についての研究も徐々に進んでおり，AX摂取後のラットでは，幹らにより血液中の過酸化脂質の生成抑制が報告されている2,8）．水溶液中でのAXのsuperoxide消去に関する報告としては，invitroの系では，アミノ酸（L-リジン：di-L-lysinate）結合型のAXが，水溶液中での高い拡散を示しsuperoxideを直接消去するという報告12）や，invivoの系では，ラット，O2・－H2O・OHLHLOOHAX1O2消去産生抑制Superoxide消去活性補助SODカタラーゼGpx+GSHFe，Cuイオン存在下Gpx+GSH消去H2O2L・,LO・,LOO・L-AAGSH活性酸素の生成経路と過酸化脂質の生成1O2：一重項酸素O2・－：スーパーオキシドアニオンラジカルH2O2：過酸化水素・OH：ヒドロシキルラジカルAX：アスタキサンチンSOD：スパーオキシドジスムターゼL-AA：L-アスコルビン酸Superoxide消去物質LH：脂質L・：脂質ラジカルLO・：アルコキシルラジカルLOO・：ペルオキシラジカルLOOH：過酸化脂質GSH：還元型グルタチオンGpx：グルタチオンペルオキシダーゼH2O2消去物質図7AXの活性酸素種に対する消去効果———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.26，No.2，2009233（95）ウサギ，イヌなどで二ナトリウム二コハク酸塩のAX（CardaxTM，disodiumdisuccinateastaxanthin：DDA）が虚血再還流時に産生されるsuperoxideを直接消去し，心臓の保護効果を示す報告などがある13）．最近，水溶液中での蛋白質結合型のAXのsuperoxide消去効果についても明らかとなりつつあり，今後，これらの複合体は臨床医学的な応用を含め，水系内での作用の解明に期待が寄せられている．現時点においては，DDAのような複合体を形成していないAXの摂取後における水系内でのsuperoxide消去活性についてはまだ報告がないため，今回，水系である房水中で本研究を行う意義があると考え検討を行うこととした．今回筆者らが測定を行った房水では，superoxideの消去活性が摂取後の房水で高値であり，直接あるいは間接的にAXがsuperoxideの消去に関与した可能性が考えられる．すなわち，房水中のAXが蛋白質結合型で存在し，その蛋白質結合型のAXが直接superoxideの消去能を示したか，あるいはAXが直接superoxide消去に働かない場合でも，間接的に他のsuperoxide消去物質の活性を高める補助効果を示したことも考えられる．たとえば，ビタミンE（a-トコフェロール）が過酸化物消去に働くGpxの必要量を減少させるのと同様に，AX摂取によって，房水中のGpxやGSHが過酸化脂質，過酸化水素など過酸化物の消去に消費される割合が減少したために，相対的にGSHが増加し，superox-ide消去活性に余裕が出たという可能性も考えられる．あるいは，AXが血液あるいはリンパ液中など体液中や肝臓などその他全身の各組織で抗酸化機能を発揮して過酸化率が減少し，その結果として房水中へ移行する以前で過酸化度合いが減少し，L-アスコルビン酸，GSHなどのsuperoxide消去物質の半減期が延長など，間接的な効果も推察される．今回の測定結果によると，両群ともにAX摂取後でsuper-oxide消去活性値が高くなり，DM群で有意な上昇がみられた（図2）．糖尿病者は過酸化反応が進行しやすいので，AX摂取前のDM群のsuperoxide消去活性値は非DM群に比べ低値であったが，AX摂取により低下していた消去活性が非DM群レベルに上昇した．変化率でみても，非DM群に比べDM群は高い傾向があった（図3）．性差による検討では，両群ともに男性で変化が大きくみられた（図46）．AX摂取前値では総男性と総女性の間で有意に男性が低値であったが，特に非DM群において男性が女性に対し低値であった．現時点においてヒト房水のsuper-oxide消去活性の性差に関する報告はないが，今回の結果は，元来，抗酸化作用に性差の影響があることを反映しているものと予想される．性差の原因として喫煙の関与を検討したが，本研究の対象者のなかで喫煙の習慣がある例は女性に1例（1日20本未満）のみであり，データ解析に影響したことは考えられない．今回は6mg/日のAX摂取量で測定を行ったが，AX摂取量の増加により性差の影響が変わる可能性も考えられる．今後，AX摂取量を各段階に分けた用量設定での測定に興味がもたれる．今回は，市販品サプリメントであるアスタビータR（富士化学工業株式会社製）を用いて研究を行ったため，サプリメントとしての推奨摂取量であるAX6mg/日をそのまま用いて研究を行った．推奨量の決定に関しては，健常成人を対象とした摂取量設定試験が報告14）されており，そのなかでAX6mg/日以上の摂取で眼の調節力向上および眼精疲労でみられる自覚症状改善効果があったとされていることから，アスタビータRの摂取量としてAX6mg/日が現在採用されている．今回の研究から，糖尿病時など，ヒト房水中でsuperox-ide消去活性が不足している場合には，AXは活性を補助し高める可能性が考えられ，特に男性でその効果が高いことが判明した．AXは今後，白内障をはじめとして，オキシデーションが関連した種々の疾患に有用な抗酸化剤として期待される．文献1）小原喜隆：第99回日本眼科学会総会宿題報告Ⅰ活性酸素・フリーラジカルと眼疾患活性酸素・フリーラジカルと白内障．日眼会誌99：1303-1341,19962）幹渉：カロテノイドの食品機能性─特に「抗酸化」活性について─．ILSI76：27-35,20033）橋本浩隆，高橋二郎，筑田眞ほか：白内障手術後におけるアスタキサンチンの炎症抑制効果．あたらしい眼科24：1357-1360,20074）MoellerSM,ParekhN,TinkerLetal：Associationsbetweenintermediateage-relatedmaculardegenerationandluteinandzeaxanthinintheCarotenoidsinAge-relatedEyeDiseaseStudy（CAREDS）：ancillarystudyoftheWomen’sHealthInitiative.ArchOphthalmol124：1151-1162,20065）花田寿郎，茂手木晧喜：血清（漿）スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）測定法の基礎的検討と臨床的意義．臨床検査機器・試薬8：629-635,19856）二気鋭雄，野口範子：生体のもつ活性酸素・フリーラジカルの消去作用．フリーラジカル（近藤元治編），p22-26,メジカルビュー社，19937）KuhnR,SoerensenNA：Thecoloringmattersofthelob-ster（AstacusgammarusL.）.ZAngewChem51：465-466,19388）MikiW：Biologicalfunctionsandactivitiesofanimalcaro-tenoids.Pure&ApplChem63：141-146,19919）ShimizuN,GotoM,MikiW：Carotenoidsassingletoxy-genguenchersmarineorganism.FishSci62：134-137,199610）塚原寛樹，福原育夫，竹原功：アスタキサンチン含有ソフトカプセル食品の健常成人に対する長期摂取における安全性の検討．健康・栄養食品研究8：27-37,2005———————————————————————-Page6234あたらしい眼科Vol.26，No.2，2009（96）11）高橋二郎，塚原寛樹，湊貞正：ヘマトコッカス藻アスタキサンチンの毒性試験─Ames試験，ラット単回投与毒性試験，ラット90日反復経口投与亜慢性毒性試験─．臨床医薬20：867-881,200412）ZsilaF,FitosI,BikadiZetal：Invitroplasmaproteinbindingandaqueousaggregationbehaviorofastaxanthindilysinatetetrahydrochloride.BioorgMedChemLett14：5357-5366,200413）LockwoodSF,PennMS,HazenSLetal：TheeectsoforalCardax（disodiumdisuccinateastaxanthin）onmulti-pleindependentoxidativestressmarkersinamouseperi-tonealinammationmodel：inuenceon5-lipoxygenaseinvitroandinvivo.LifeSci79：162-172,200614）新田卓也，大神一浩，白取謙治ほか：アスタキサンチンの調節機能および疲れ眼におよぼす影響─健常成人を対象とした摂取量設定試験─．臨床医薬21：543-556,2005＊＊＊