———————————————————————-Page1（125）11310910-1810/09/\100/頁/JCOPYあたらしい眼科26（8）：11311137，2009cはじめに糖尿病は若年者でも白内障を進行させることから，問題視されている1,2）．ラットにガラクトースを投与し発生する糖白内障はヒト糖尿病白内障と類似点が多いことから，糖尿病白内障メカニズムの解明のためさまざまな研究3,4）が行われてきた．これまでの研究により糖白内障は，糖代謝異常により糖アルコールの蓄積が生じ，水晶体線維細胞が膨化，破壊され5），水晶体が混濁すると考えられている．水晶体は高蛋白質の組織であり蛋白質の恒常性は水晶体の透明性維持に重要であるが，糖白内障においては実際に生じている蛋白質変化を解析した報告は少ない．そこで今回筆者らは糖白内障の蛋白質変化に着目した．ラットにガラクトースを投与し，細隙灯を用いて糖白内障の進行を経時的に観察した．水晶体の透明性維持に重要な役割をもつと考えられる細胞骨格蛋白質6）を中心に水晶体蛋白質を分子生物学的および免疫組織学的に解析した．〔別刷請求先〕松島博之：〒321-0293栃木県下都賀郡壬生町北小林880獨協医科大学眼科学教室Reprintrequests：HiroyukiMatsushima,M.D.,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,DokkyoMedicalUniversity,880Kitakobayashi,Mibu,Shimotsuga-gun,Tochigi321-0293,JAPANガラクトースラット糖白内障モデルの蛋白質解析武井千明＊1向井公一郎＊2松島博之＊2妹尾正＊2小原喜隆＊1＊1国際医療福祉大学＊2獨協医科大学眼科学教室ProteinAnalysisUsingGalactosemicRatCataractModelChiakiTakei1）,KoichiroMukai2）,HiroyukiMatsushima2）,TadashiSenoo2）andYoshitakaObara1）1）InternationalUniversityofHealthandWelfare,2）DepartmentofOphthalmology,DokkyoMedicalUniversityガラクトース糖白内障の観察と蛋白質変化を解析し糖尿病白内障の原因を検討した．生後9週齢のSprague-Daw-ley（SD）ラットを使用し，50％ガラクトース食餌群（糖白内障群），通常食餌群（対照群）を作製した．経時的に水晶体を細隙灯で観察し，水晶体の混濁をグレード分類した．2，4週に眼球を摘出して水晶体を採取し，蛋白質変化を解析した．細隙灯による観察結果では，糖白内障群は2週から周辺部皮質に軽度混濁が生じ経時的に進行し，4週目には高度の白内障に進行した．対照群ではいずれの時期にも混濁は観察されなかった．糖白内障群は蛋白質密度解析とウェスタンブロッティングで4週目に細胞骨格蛋白質領域のバンドの減少が確認された．免疫組織化学染色を行うと，糖白内障群では投与1週目より水晶体皮質表層に細胞配列と細胞骨格蛋白質の異常を認めた．糖白内障の進行性と細胞骨格蛋白質の関連性について考察した．Causesofcataractinthegalactose-inducedratcataractmodelwereclariedthroughobservationofcataractdevelopmentandanalysisofproteinchanges.Approximately9-weekoldSprague-Dawley（SD）ratswerepre-paredandseparatedinto2groups：thediabeticcataractgroup（50％galactose-fedrats）andthecontrolgroup（normallyfedrats）.Theirlenseswereobservedviaslit-lampandgradedatselectedtimepoints.At2and4weeks,thelensesweredissectedfrombothgroupsandsubjectedtoproteinanalysis.Inthediabeticcataractgroup,slightopacicationwasobservedincorticalpartsat2weeks,developingintosevereopacicationat4weeks.Nosignicantchangeswereobservedinthecontrolgroup.Densitometryanalysisandwesternblottingshowedadecreaseincytoskeletalproteinsat4weeks.Immune-histologicalanalysisshowedabnormalitiesofcellalignmentandcytoskeletalproteinsinthesurfaceofthelenscortexafter1week.Changesinthecytoskeletalpro-teinsandthecauseofdiabeticcataractdevelopmentareconsidered.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）26（8）：11311137,2009〕Keywords：糖白内障，ガラクトースラット白内障，細胞骨格蛋白質，蛋白質解析，ウェスタンブロッティング，免疫組織学．diabeticcataract,galactosemicratcataractmodel,cytoskeletalprotein,proteinanalysis,westernblot-ting,immunohistology.———————————————————————-Page21132あたらしい眼科Vol.26，No.8，2009（126）I対象および方法1.ラット糖白内障の観察生後9週齢約180gの雌のSprague-Dawley（SD）ラットを24匹用意し，無作為に2群に分けた．ラットの実験に関しては，動物実験の飼養および保管に対する基準（NationalInstitutesofHealthGuidelinesontheCareandUseofLaboratoryAnimalsinResearchおよびARVOStatementfortheUseofAnimalsinOphthalmicandVisionResearch）に基づいて行った．1群を対照群とし，通常食餌であるMF（飼育用）実験動物用固形試料（オリエンタル酵母工業株式会社）のみを与えた．もう1群を糖白内障群としてMF実験動物用固形飼料にガラクトースを50％含有させた飼料を与えた．給水は自由に取らせ，1匹当たり1日13gすべての飼料を食べていることを目視で確認した．実験開始から1週ごとに細隙灯を用いて，前眼部撮影を行った．細隙灯の観察結果をもとに白内障の進行をSippelの報告7）を基にGrade0から4に分類（表1）しグラフ化した．2.ラット糖白内障の水晶体蛋白質解析ガラクトース投与2，4週で6匹ずつ安楽死させ眼球摘出を行った．眼球摘出後，水晶体を採取し氷上に置くことで水晶体核部を混濁させる寒冷白内障を発症させ，水晶体核と皮質に分離し実験に使用するまで80℃で冷凍保存した．摘出した水晶体の蛋白質量が微量なため，単一個体の2眼を1つのサンプルとした．核と皮質をそれぞれ水溶性蛋白質と不水溶性蛋白質に分けるため，それぞれにホモジェネートバッファー（EGTA）（20mMsodiumphosphate＋1.0mMethyl-eneglycol-bis（b-aminoethylether）-N,N,N￠,N￠-tetraa-ceticacid,pH7.0）を50μl加えてホモジェネートし，遠心分離（10,000g，10分間）を行い，得られた上清を別のマイクロチューブに移し，再び同じ操作を2回くり返した．上清成分を水溶性蛋白質，残った沈殿物を不溶性蛋白質として，不溶性蛋白質に8M尿素を加えて溶解し，解析に使用した．採取した蛋白質濃度をBCAProteinAssayKit（PIERCE）を用いて測定した．蛋白質濃度測定後，一次元電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動：SDS-PAGE）を，200Vで約1時間20分間行った．発色にはクーマッシーブルルアントブルー溶液を使用し，脱色後ゲルドライキット（TEFCO）を用いてゲルを乾燥保存した．電気泳動で得た蛋白質のバンドを量的に解析するためゲルをスキャナ（8bit/pixel）で取り込み，Scionimage（Scion社）を用いて蛋白質バンドを定量して，蛋白質全体量に対するバンド密度の割合を算出することで蛋白質密度解析を行った．統計学的解析にはWelcht検定を用い，p＜0.05を有意差ありとした．また免疫学的に蛋白質を同定するためにウェスタンブロッティングを行った．上記と同じ方法を用いて電気泳動を行い，転写膜にはPVDF（polyvinylidenediuoride）膜を用いて26Vで2時間転写を行った．ブロッキング液には5％non-fat-dry-milk,0.1％Tween20溶液を用いた．一次抗体として抗ビメンチン抗体を200倍希釈，抗アクチン抗体を200倍希釈して使用し，二次抗体としてalkalinephos-対照群糖白内障群3週2週4週1週図1ラット糖白内障観察結果細隙灯を用いて撮影した水晶体の経時的変化の1例．上段の対照群ではすべての週で透明水晶体が確認された．下段の糖白内障群は，2週から泡状の淡い混濁が周辺部に発現し，3週，4週で混濁は後中心方向に向け増強した．表1ラット糖白内障グレード分類Grade0混濁なしGrade1赤道部の混濁Grade2赤道部から皮質1/2以下の混濁Grade3赤道部から皮質1/2以上の混濁Grade4水晶体中心部付近までの混濁細隙灯で観察した水晶体をGrade0からGrade4まで分類した．———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.26，No.8，20091133（127）phataseconjugateのanti-mouseIgG抗体（Bio-Rad）を使用し，BCIP/NBT（5-bromo-4-chloro-3￠indolyphosphate/nitro-bluetetrazoliumchloride，Bio-Rad）で発色した．3.組織学的解析組織学的解析にはSDラット4匹を使用した．ガラクトース投与1，2週目に対照群と糖白内障群の1匹ずつ眼球を摘出し，カルノア固定を行った．脱水後，パラフィンに包埋し，4μmの組織切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン染色した．細胞骨格蛋白質の変化をみるために免疫組織染色を行い，一次抗体として抗ビメンチン抗体（SIGMA×100），抗アクチン抗体（MPbiomedicals×100）を使用し，ヒストファインSAB-PO（MULTI）キット（ニチレイ）を用いてストレプトアビジン・ビオチン法にて増感し，発色にはジアミノベンチジンを使用した．II結果1.ラット糖白内障の観察図1に対照群，糖白内障群の水晶体を細隙灯で観察した経過の1例を示す．対照群では，いずれの週においても混濁は生じていなかった．糖白内障群では2週から周辺部に泡状の混濁が発生し，3週では後中心部に向け混濁が強まり，4週には後全体に混濁が広がった．グレード分類したグラフを図2に示す．対照群では経過観察中，混濁のグレードは0のままであるが，糖白内障群では，経過とともに混濁が増強していた．2.ラット糖白内障の水晶体蛋白質解析SDS-PAGEにおいて核領域水溶性および不溶性蛋白質，皮質領域水溶性蛋白質では，対照群と糖白内障群の間で差を認めなかった（データ表示せず）．皮質領域不溶性蛋白質のSDS-PAGE（図3）では，2週において対照群と糖白内障群に差異は確認できないが，4週では対照群に比べ，糖白内障群の高分子量領域の蛋白質量が減少していた．皮質領域不溶性蛋白質を構成する細胞骨格蛋白質であるビメンチンとアクチンの変化を蛋白質密度解析で定量した結果（図4），57kDaのビメンチン領域において2週では対照群と糖白内障群に有意差はないが，4週では対照群と比較して糖白内障群の蛋白質量は有意に減少していた（p＜0.01）．48kDaのアクチン領域においては，2，4週ともに有意差を認めなかった．図5に皮質領域不溶性蛋白質のウェスタンブロッティングの結果を示す．2週では対照群，糖白内障群ともに抗ビメンチン抗体，抗アクチン抗体により，ビメンチン，アクチンが検出された．4週では，対照群のバンドは検出されたが，糖白内障群の4週においてビメンチン，アクチンの抗体反応蛋白質量が低下していた．3.ラット糖白内障の組織学的解析ヘマトキシリン・エオジン染色を行った結果を図6に示す．対照群では投与1週，2週目で線維細胞の配列が確認できた．糖白内障群では投与1週目に赤道部から後の表層皮質にかけて線維細胞は膨潤し，細胞膜に融解がみられ皮質に空胞を呈していた．前，後付近の表層皮質も細胞配列の異常が生じていた．投与2週目では，赤道部に崩壊した線維細胞が多数存在し，前，後にも空胞を呈していた．抗ビメンチン抗体の免疫組織染色の結果を図7に示す．対照群では線維細胞の配列に沿って均一な陽性染色を認めたのに対して，糖白内障群では投与1週目から表層皮質の細胞配2週4週20011596513729207kDa20011596513729207kDa対照群糖白内障群対照群糖白内障群→図3皮質領域不溶性蛋白質のSDSPAGE皮質領域不溶性蛋白質のSDS-PAGEの結果を示す．2週では対照群と糖白内障群に明らかな差異は確認されないが，4週で糖白内障のバンドが減少，消失している（矢印部）．012341234（週）Grade：対照群：糖白内障群n＝6図2ラット糖白内障グレード分類結果対照群はすべての週でGrade0であったが，糖白内障群は週の経過とともに混濁が増強した．———————————————————————-Page41134あたらしい眼科Vol.26，No.8，2009（128）列異常が生じている部位に一致して不均一な陽性染色を認めた．2週では不均一な陽性染色はさらに強まり，前部，後部付近も変性傾向にあった．抗アクチン抗体で免疫染色した結果を図8に示す．抗ビメンチン抗体染色と類似して1週目の赤道部，2週目の前部など細胞配列異常が生じている部位に一致して不均一な染色を認めた．III考察糖尿病が白内障の発症要因となることはわかっているが，メカニズムについてはいまだ不明な点も多い．糖白内障の原因の一つとして，糖アルコールであるガラクチトールの蓄積が関与していると考えられているが，ガラクチトールの濃度を測定した報告8）では，50％のガラクトースを負荷したラットの水晶体で4.5から8.5日目に濃度がピークに達し白内障出現時期には濃度が低下していたとされている．このことからも単にガラクチトールの蓄積が直接水晶体を混濁しているのではなく，ガラクチトールの蓄積により生じるさまざまな障害により白内障が発生した可能性が示唆される．糖白内障の発症機序については他にも報告があり，糖代謝異常によるATP（アデノシン三リン酸）産生の低下や細胞膜の異常9），水晶体細胞内へのカルシウム流入によるカルパインなどのカルシウム依存性の蛋白質分解酵素が活性化し，細胞骨格蛋白質が分解される可能性を示唆している報告1012），線維細胞の膨化，崩壊による，無機イオン，アミノ酸，ミオイノシトールなどの細胞膜維持に関与物質の水晶体外漏出13）や，抗酸化作用のあるスーパーオキシドディスムターゼの活性が低下による蛋白質凝集の可能性を示唆した報告14）などがある．蛋白質密度（）蛋白質密度（）01234564週2週012345：対照群：糖白内障群＊4週2週6aｂ図4蛋白質密度解析結果SDS-PAGEの蛋白質密度を解析した．aがビメンチン領域，bがアクチン領域．ビメンチン領域の4週の結果で対照群と糖白内障群に有意差を認めた（＊：p＜0.01）．投与2週投与4週ab対照群糖白内障群対照群糖白内障群対照群糖白内障群対照群糖白内障群図5皮質領域不溶性蛋白質のウェスタンブロッティング結果皮質領域不溶性蛋白質を抗ビメンチン抗体（a），抗アクチン抗体（b）を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す．2週ではビメンチン，アクチンの存在が確認できるが，4週の糖白内障群ではビメンチン，アクチンともに抗体の反応が低下，消失している．———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.26，No.8，20091135（129）しかし，糖白内障における水晶体蛋白質の変化を検討した報告は少ない．筆者らは，以前より水晶体透明性維持と細胞骨格蛋白質の関係6）について着目しており，今回糖白内障モデルを用いて水晶体混濁と細胞骨格蛋白質変化について解析した．今回のモデルではガラクトース投与2週目から軽度の混濁が発症し，混濁は週の経過とともに増強した．細胞骨格蛋白質は水晶体の透明性維持に重要15,16）とされ，ビメンチンは，水晶体細胞の形状，透明性維持に関与17,18）し，アクチンは，水晶体細胞形状の維持と伸長，水晶体調節機能に関与する19）といわれている．ビメンチン，アクチンを含む細胞骨格蛋白質の減少は蛋白質間のネットワークを乱し，白内障の要因になる20）とされていることから，筆者らは細胞骨格蛋白質であるビメンチン，アクチンの変化に着目し，蛋白質解析を行った．しかし，蛋白質解析による細胞骨格蛋白質の変化は，混濁が進行した4週でのみ生じていた．そこで，白内障初期の細胞骨格の変化分布を追うために組織学的に細胞骨格を解析したところ，実験開始早期である1週，2週の糖白内障群で水晶体皮質部に細胞骨格蛋白質の異常が生じていることがわかった．今回の結果によりガラクチトールの蓄積，ATP産生の低下などが細胞骨格蛋白質を含んだ細胞膜の異常を発生させて初期の細胞骨格蛋白質の変化を生じ，活性化した蛋白質分解酵素によって細胞内の細胞骨格蛋白質が分解され，蛋白質漏出現象から後期の細胞骨格蛋白質の減少を生じたと考えた．白内障の発生原因は一つでなく，糖尿病白内障だけでもさまざまな組織化学的変化が複雑に絡み，水晶体蛋白質間のネットワークが破壊され，白内障が進行していく．細胞骨格蛋白質変化は糖白内障を発生させる要因の一つであるが，細胞骨格蛋白質変化を解明するだけでは糖白内障のメカニズムを解明することはできない．糖代謝異常によって生じる複雑な水晶体成分の変化を一つひとつ解明していくことが，糖白1週2週2週1週abc対照群糖白内障群図6組織学的解析ヘマトキシリン・エオジン染色上段が対照群，下段が糖白内障群を示し，a：赤道部，b：前部，c：後部の結果を各々示す．投与1週の対照群赤道部では水晶体上皮細胞が弧状形状を保ちながら水晶体核部に移動しているが，ガラクトース白内障群では細胞の配列は不均一で細胞間隙が開いている（↑）．投与2週になると糖白内障群で前部，後部に空胞化がみられ，赤道部皮質では細胞配列の乱れが生じている．cap：水晶体，cortex：水晶体皮質，Bar＝100μm．———————————————————————-Page61136あたらしい眼科Vol.26，No.8，2009（130）内障のメカニズム解明や，予防法の確立に重要であると思われる．本論文の要旨は，第47回日本白内障学会にて発表した．文献1）藤永豊：糖尿病性白内障．眼科MOOK8：220-233,19792）髙村佳弘，久保江理，赤木好男：糖尿病白内障．眼科45：1267-1275,20033）RobisonWGJr,HoulderN,KinoshitaJH：Theroleoflensepitheliuminsugarcataractformation.ExpEyeRes50：641-646,19904）DvornikE,Simard-DuquesneN,KramiMetal：Polyolaccumulationingalactosemicanddiabeticrats：controlbyanaldosereductaseinhibitor.Science182：1146-1148,19735）KinoshitaJH：Mechanismsinitiatingcataractformation.Proctorlecture.InvestOphthalmol13：713-724,19746）MatsushimaH,DavidLL,HiraokaTetal：Lossofcytoskeletalproteinsandlenscellopacicationinthesele-nitecataractmodel.ExpEyeRes64：387-395,19977）SippelT：Changesinthewater,protein,andgalactosecataractdevelopmentinrats.InvestOphthalmol5：568-575,19668）竹村俊彦：ガラクトース負荷ラットにおけるガラクチトールの影響について．阪市医誌39：233-252,19909）小原喜隆：病因．眼科学大系水晶体，p113-126，中山書店，199510）SandersonJ,MarcantonioJM,DuncanG：Ahumanlensmodelofcorticalcataract：Ca2＋-inducedproteinloss,vimentincleavageandopacication.InvestOphthalmolVisSci41：2255-2261,200011）MarcantonioJM,DuncanG：Calcium-induceddegrada-tionofthelenscytoskeleton.BiochemSocTrans19：1148-1150,199112）YoshidaH,MurachiT,TsukaharaI：DegradationofactinandvimentinbycalpainII,aCa2＋-dependentcysteineproteinase,inbovinelens.FEBSLett21：259-262,19841週2週2週1週abc対照群糖白内障群図7組織学的解析免疫組織染色（抗ビメンチン抗体）抗ビメンチン抗体組織免疫染色の結果．上段が対照群，下段が糖白内障群を示し，a：赤道部，b：前部，c：後部の結果を各々示す．投与1週の対照群赤道部では均一に抗ビメンチン抗体陽性部位が観察できた．糖白内障群では赤道部と後部に細胞配列の乱れが生じている部位に一致して抗ビメンチン抗体強陽性反応を認めた（＊）．投与2週でも糖白内障群では抗ビメンチン抗体強陽性反応がみられたが，空胞化のみられた部位には反応を認めない（※）．———————————————————————-Page7あたらしい眼科Vol.26，No.8，20091137（131）13）KinoshitaJH：Aldosereductaseinthediabeticeye.XLIIIEdwardJacsonMemorialLecture.AmJOphthalmol102：685-692,198614）橋本浩隆：糖尿病者白内障と非酵素的糖化反応の関係．日眼会誌102：34-41,199715）IrelandM,MaiselH：Ev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