0910-1810/11/\100/頁/JCOPY（125）1029《原著》あたらしい眼科28（7）：1029?1033，2011cはじめに眼表面の涙液層は，表層から油層，水層およびムチン層の3層で構成され，そのうち水層は種々の蛋白質，電解質および水分から成り，眼表面の環境維持において生理学的役割は大きい1）．ドライアイ患者の眼表面では，涙液の分泌低下あるいは蒸発亢進により，涙液3層構造が崩れ，各涙液層の役割が正常に機能せず，異常をきたしている．したがって，その治療には，眼表面における涙液層を質的および量的に正常化させることが望まれる．現在，国内でドライアイの治療に使用されている薬剤は，人工涙液および角結膜上皮障害治療剤であるヒアルロン酸ナトリウム点眼液のみである．人工涙液は，一時的な水分および電解質の補充効果しか期待できず，ヒアルロン酸ナトリウム点眼液は，角膜上皮伸展促進作用および保水性による涙液層の安定化作用を示すものの，極度に涙液量が減少しているドライアイ患者では，保水効果による治療効果は低いと考え〔別刷請求先〕七條優子：〒630-0101生駒市高山町8916-16参天製薬株式会社研究開発センターReprintrequests：YukoTakaoka-Shichijo,Research&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.,8916-16Takayamacho,Ikoma,Nara630-0101,JAPAN正常ウサギにおけるジクアホソルナトリウムの涙液分泌促進作用七條優子村上忠弘中村雅胤参天製薬株式会社研究開発センターStimulatoryEffectofDiquafosolTetrasodiumonTearFluidSecretioninNormalRabbitsYukoTakaoka-Shichijo,TadahiroMurakamiandMasatsuguNakamuraResearch&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.P2Y2受容体作動薬であるジクアホソルナトリウムの正常ウサギにおける涙液分泌促進機序について検討した．ジクアホソルナトリウムは，点眼15分後を最大とする用量依存的な涙液分泌促進作用を示した．また，ジクアホソルナトリウムは，涙液中蛋白質濃度には影響を及ぼさなかったが，涙液中の蛋白質量を用量依存的に増加させた．一方，ウサギ摘出涙腺組織に1,000μMまでのジクアホソルナトリウムを作用させたが，蛋白質分泌には影響を与えなかった．さらに，ウサギ結膜組織を用いた実験では，ジクアホソルナトリウムは，結膜組織からの水分分泌速度と正の相関性を示す組織膜に発生する電流値，膜電流を濃度依存的に上昇させ，本上昇作用は，カルシウムキレート剤の前処理により抑制された．以上より，ジクアホソルナトリウムは，おもに結膜細胞に作用し，細胞内カルシウムイオンを介して涙液の分泌促進作用を誘導すると考えられた．ThisstudyinvestigatedthemechanismofthestimulatoryeffectoftheP2Y2receptoragonistdiquafosoltetrasodiumontearfluidsecretioninnormalrabbits.Diquafosoltetrasodiumsolutionsinducedmaximaltearfluidsecretionat15minafterinstillation,increasinginadose-dependentmanner.Moreover,diquafosoltetrasodiumsolutionshadnoeffectonproteinconcentrationinthetearfluid,butexhibiteddose-dependentincreaseinproteincontentinit.Diquafosoltetrasodiumdidnotaffectproteinsecretionfromisolatedrabbitlacrimalglands,evenataconcentrationof1,000μM.Inrabbitconjunctivaltissues,diquafosoltetrasodiumenhancedtheshort-circuitcurrentinaconcentration-dependentmanner,positivelycorrelatedwithwatersecretionfromconjunctivaltissue.Thisenhancementwasinhibitedbypretreatmentwithcalcium-chelatingagent.Theseresultssuggestthatdiquafosoltetrasodiummayactmainlyonconjunctivaandstimulatetearfluidsecretionviatheintracellularcalciumpathway.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（7）：1029?1033,2011〕Keywords：ジクアホソルナトリウム，P2Y2受容体作動薬，涙液分泌，細胞内カルシウム，ウサギ結膜．diquafosoltetrasoidium,P2Y2receptoragonist,tearfluidsecretion,intracellularcalcium,rabbitconjunctiva.1030あたらしい眼科Vol.28，No.7，2011（126）られる2）．このように，ドライアイ治療は，十分に満足されている状況ではなく，ドライアイ患者の涙液層の質と量を改善できる新たな作用機序を有する治療薬の開発が臨床現場では強く求められている．プリン受容体の一つであるP2Y2受容体に対してアゴニスト作用を有するアデノシン3リン酸（ATP）あるいはウリジン3リン酸（UTP）は，涙液の分泌促進，ムチン（高分子糖蛋白質）の分泌促進，あるいはリゾチームの分泌促進作用などを示すことが報告され3），P2Y2受容体作動薬は，涙液層の質的および量的の両面を改善できると期待される．ジクアホソルナトリウムは，UTPと同程度のP2Y2受容体作動活性を有し4），かつATPあるいはUTPに比して水溶液中で安定性に優れている化合物である．Yerxaら5）は，ジクアホソルナトリウムが，正常ウサギにおいて涙液の分泌を誘導することを報告している．今回，筆者らは，ジクアホソルナトリウムの正常ウサギ涙液分泌促進機序について検討した．I実験方法1.ジクアホソルナトリウム点眼液ジクアホソルナトリウム（以下，ジクアホソル）は，ヤマサ醤油にて製造された．ジクアホソル点眼液は，塩化ナトリウム溶液あるいはリン酸緩衝液に溶解し，pH調節剤を用いて7.2?7.4に，等張化剤を用いて浸透圧比を1.0?1.1に調整した．2.涙液量の測定雄性日本白色ウサギ（北山ラベス，長野）の下眼瞼に，シルメル試験紙（昭和薬品化工，東京）の折り目5mm部分を挿入し，濾紙が濡れた長さを指標にして涙液量を測定した．用量依存性の検討では，0.1?8.5％のジクアホソル点眼液をウサギに点眼（50μL）し，涙液量を測定する3分前にベノキシールR点眼液0.4％（参天製薬，大阪）を10μL点眼し，眼表面を局所麻酔した．局所麻酔3分後にウサギを保定し，シルメル試験紙を挿入し，1分間に濡れたシルメル試験紙の長さ（Schirmer試験値）を測定した．また，8.5％ジクアホソル点眼液点眼5，15，30および60分後のSchirmer試験値を測定し，涙液量の経時的変化を検討した．なお，涙液量の測定には，両眼を用いた．雄性日本白色ウサギは1週間馴化飼育した後，試験に使用した．本研究は，「動物実験倫理規程」，「参天製薬の動物実験における倫理の原則」，「動物の苦痛に関する基準」などの参天製薬株式会社社内規程を遵守し実施した．3.涙液中の蛋白質濃度および蛋白質量の測定0.3?3％ジクアホソル点眼液点眼15分後の涙液量を「2.涙液量の測定」と同様の方法にて実施し，Schirmer試験値を得た後のシルメル試験紙を生理食塩液に浸し，試験紙に吸収されている蛋白質を回収した．蛋白質濃度は，Bio-Rad（CA，USA）社のBradford法に従い測定した．試験紙に吸収された蛋白質量は，蛋白質濃度にSchirmer試験値から換算された涙液量を乗じて，試験紙に吸収された蛋白質量を算出した．4.涙腺組織からの蛋白質分泌量の測定Nakamuraらの方法6）に従って，涙腺組織からの蛋白質分泌について検討した．すなわち，雄性日本白色ウサギにネンブタール注射液（大日本住友製薬，大阪）を1mL/kgになるよう静脈注射して全身麻酔し，腹部大動脈からの脱血により安楽殺した．涙腺組織を摘出し，周辺結合組織を切除し，涙腺組織切片を作製した（16片/1眼）．涙線組織切片は，60分間培養液（143.1mMNaCl,4.5mMKCl,2.5mMCaCl2・2H2O,1.2mMMgCl2・6H2O,20mMHEPES,11.0mMd-glucose,pH7.4）で培養し，組織を安定化させた後に涙腺組織からの蛋白質分泌に用いた．サンプリングは，ジクアホソルあるいはカルバコール溶液添加後60分まで20分間隔で行った．各サンプル中の蛋白質濃度値を，各組織の湿重量で除することにより，組織重量当たりの蛋白質濃度を求めた後，同組織の無添加時（20分間）に分泌された蛋白質濃度値に対する百分率で表した値を蛋白質分泌率とした．また，ジクアホソル（1?1,000μM）およびカルバコール（100μM：Sigma,MO,USA）は，培養液に溶解して使用した．5.結膜組織の膜電流値の測定雄性日本白色ウサギにネンブタール注射液を1mL/kgになるよう静脈注射して全身麻酔し，腹部大動脈からの脱血により安楽殺した．Kompellaらの方法7）に従って結膜組織を摘出し，normalbicarbonatedRinger’ssolution（BR：111.5mMNaCl,4.8mMKCl,0.75mMNaH2PO4,29.2mMNaHCO3,1.04mMCaCl2・2H2O,0.74mMMgCl2・6H2O,5.0mMd-glucose）を満たしたUssingチャンバー内に結膜組織（1組織/1眼）を固定し，膜電流を安定させた．チャンバーに固定した組織における膜電流の変動は，短絡電流測定装置（CEZ-9100；日本光電，東京）を用いて実施した．ジクアホソルおよびカルシウムキレート剤である1,2-bis-（o-aminophenoxy）ethane-N,N,N￠,N￠-tetraaceticacidtetra-（acetoxymethyl）ester（BAPTA-AM：Merck，Darmstadt，Germany）は，BRに溶解して使用した．ジクアホソルを，涙液（上皮）側に添加する前後の膜電流を測定し，膜電流の変化値を算出した．なお，BAPTA-AM（最終濃度3，10あるいは30μM）は，ジクアホソル（10μM）の添加前に60分間反応させた．6.統計解析EXSAS（アーム，大阪）を用いて，5％を有意水準として解析した．2群比較の場合は，基剤群に対するStudentのt検定，3群以上の比較には，基剤群に対するDunnettの多重比較検定を実施した．（127）あたらしい眼科Vol.28，No.7，20111031II結果1.正常ウサギにおける涙液分泌促進作用ジクアホソルの正常ウサギにおける涙液分泌促進作用について検討した．経時的検討では，8.5％ジクアホソル点眼液の点眼5分後からSchirmer試験値は増加し，点眼5，15および30分後において，基剤群に比し有意に増加した（5分：p＜0.01，15分：p＜0.01，30分：p＜0.05）．Schirmer試験値は点眼15分後に最大値を示し，その後Schirmer試験値は減少した（図1a）．点眼15分後における用量依存性の検討では，ジクアホソル点眼液は，用量依存的にSchirmer試験値を増加させ，基剤点眼に比し0.3％点眼で約2倍，1?8.5％では約3倍と用量依存的に増加し，1％の用量で効果はプラトーに達した．その効果は基剤群に比し0.3％以上の用量で有意であった（0.3％：p＜0.05，1.0％，3.0％および8.5％：p＜0.01）（図1b）．また，ジクアホソル点眼液点眼後の涙液中蛋白質濃度は，いずれの用量においても約30mg/mLであり，基剤群と有意な差は認められなかった（図2a）．さらに，涙液中蛋白質量は，ジクアホソル点眼液の用量に依存して増加し，その効果は1％および3％において有意であった（1％および3％：p＜0.01）（図2b）．2.涙腺組織からの蛋白質分泌作用に及ぼす影響ジクアホソルの涙腺への反応性の有無を確認する目的で，ウサギ涙腺組織からの蛋白質分泌に及ぼす影響について検討した．図3に示すように，陽性対照薬である100μMカルバコール溶液は，0?20分間の反応において，ウサギ涙腺組織からの蛋白質分泌率を有意に増加させた（p＜0.05）．一方，1?1,000μMのジクアホソル溶液を反応させた場合は，60分間のいずれの測定時間においても，ウサギ涙腺組織からの蛋白質分泌率に何ら影響を及ぼさなかった．3.結膜組織における膜電流の上昇作用およびカルシウムキレート剤の影響結膜組織からの水分輸送（分泌）速度は，結膜組織における膜電流の変化値と相関することが報告されている8）ことより，ジクアホソルによるウサギ結膜組織の膜電流の変化値を測定した．表1に示すように，膜電流の変化値は，10μMジクアホソル溶液の添加により上昇し，100μMジクアホソル溶液でさらに上昇した．また，10μMジクアホソル溶液による膜電流の促進作用は，カルシウムキレート剤であるBAPTA-AM3，10あるいは30μMの前処理により，濃度依存的に抑制された．その抑制作用は，10μM以上のBAPTA-AMにより有意であった（10μM：p＜0.05，30点眼後の時間（分）Schirmer試験値（mm）無処置5無処置＊＊＊♯♯♯＊＊153060ジクアホソル（％）20151050基剤0.10.3138.5■：基剤■：8.5％ジクアホソルaSchirmer試験値（mm）20151050b図1正常ウサギにおけるジクアホソル点眼液の涙液分泌促進作用a：経時的変化，b：用量依存性．各値は6眼の平均値±標準誤差を示す．＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01（Studentのt検定）．＃：p＜0.05，＃＃：p＜0.01（Dunnettの多重比較検定）．＊＊＊＊ジクアホソル（％）ジクアホソル（％）50403020100基剤0.313基剤0.313a蛋白質量（μg）蛋白質濃度（mg/mL）4003002001000b図2正常ウサギにおけるジクアホソル点眼液による涙液中蛋白質分泌促進作用a：蛋白質濃度，b：蛋白質量．基剤および1％点眼群は9眼，0.3および3％点眼群は10眼の平均値±標準誤差を示す．＊＊：p＜0.01，基剤群との比較（Dunnettの多重比較検定）．1032あたらしい眼科Vol.28，No.7，2011（128）μM：p＜0.01）（図4）．III考按ジクアホソルは，Yerxaら5）によりドライアイ治療において重要な作用の一つである涙液の分泌を誘導させることが報告されている．今回の試験でも，Yerxaら5）の報告と同様に正常ウサギにジクアホソル点眼液を点眼することで，涙液量を示すSchirmer試験値は用量依存的に上昇した．しかし，その作用機序については十分に解明されていない．そこで，ジクアホソルの涙液分泌促進機序を明らかにする目的で，ジクアホソルの作用部位について検討した．ジクアホソルの点眼により，涙液量は増加するにもかかわらず，涙液中蛋白質濃度には影響なく，蛋白質量は増加することから，ジクアホソルは水分だけでなく蛋白質の分泌も促進していると考えられた．水分および蛋白質の分泌が可能な組織としては，涙腺組織が考えられる．そこで，ジクアホソルの作用部位として，涙腺の可能性を検討する目的で，正常ウサギ涙腺組織におけるジクアホソルの蛋白質分泌について検討した．しかし，ジクアホソルを涙腺組織に1,000μMまで作用させても，対照薬として用いたカルバコールのような蛋白質分泌促進作用を示さなかった．また，ジクアホソルは，これまでに報告されている涙腺摘出ラットドライアイモデル，すなわち涙腺が存在しない動物モデルにおいても涙液分泌促進作用を示すことより9），ジクアホソルは，涙腺以外の部位に作用している可能性が高いと考えられた．P2Y2受容体は，アカゲザルの眼瞼および眼球結膜組織において，杯細胞を含む結膜上皮細胞，マイボーム腺脂肪細胞およびマイボーム腺導管上皮細胞での発現が認められている10）．また，Candiaら11）は，角結膜上皮層から眼表面への水分輸送機能について報告していることから，つぎに作用部位として，結膜組織の可能性について検討した．Liら8）の報告同様，今回の検討でもジクアホソルによりウサギ結膜組織の膜電流の上昇作用が認められ，水分の分泌促進作用が示唆された．また，ジクアホソルは，ウサギ結膜上皮からの糖蛋白質（過ヨウ素酸Schiff染色陽性蛋白質）の分泌を促進することも報告されている12）．したがって，ジクアホソルは，水分および涙液成分の分泌促進作用を示すためのおもな作用部位は，結膜組織，すなわち結膜上皮細胞であると考えられた．P2Y2受容体作動薬は，ヒト線維芽細胞において，G蛋白を介してホスホリパーゼCを活性化し，イノシトール3リン酸を生成した結果，細胞内小胞体からのカルシウムイオンの放出を誘導し，細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる13）．また，ヒト角膜上皮細胞において，細胞内カルシウムイオンが上皮側に存在するカルシウム依存性Clイオンチャンネルを開口し，細胞内のClイオンを涙液側に輸送した結果生じる浸透圧差により，上皮側への水分分泌を促進する14）．さらに，筆者らは初代培養ウサギ結膜上皮細胞においてジクアホソルが濃度依存的に細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させることを確認している15）．したがって，本試験では，結膜組織におけるジクアホソルの水分分泌促進作用に及ぼすカルシウムイオンの関与を明らかにする目的で，ウサギ結膜組織を用いてジクアホソルにより上昇した膜電流値，すなわち水分分泌促進作用に及ぼすカルシウムキレート剤の影響につい培養時間（分）30020010000～2020～4040～60蛋白質分泌率（％）■：基剤■：1μMジクアホソル■：10μMジクアホソル■：100μMジクアホソル■：1,000μMジクアホソル■：100μMカルバコール＊図3正常ウサギ涙腺組織からの蛋白質分泌率に及ぼすジクアホソルの影響各値は5例の平均値±標準誤差を示す．＊：p＜0.05，基剤群との比較（Studentのt検定）．BAPTA-AM（μM）膜電流の変化（μA/cm2）201510500310＊30＊＊図4正常ウサギ結膜組織におけるジクアホソルによる膜電流上昇作用に及ぼすカルシウムキレート剤の影響各値は5例の平均値±標準誤差を示す．BAPTA-AMは，10μMジクアホソル添加前に60分間反応させた．＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01，基剤（0μMBAPTA-AM）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．表1正常ウサギ結膜組織におけるジクアホソルの膜電流上昇作用群用量（μM）例数膜電流の変化（μA/cm2）ジクアホソル10811.91±0.64ジクアホソル100518.60±1.62各値は平均±標準誤差を示す．（129）あたらしい眼科Vol.28，No.7，20111033て検討した．その結果，ジクアホソルによる膜電流値の上昇作用は，BAPTA-AMの前処理により濃度依存的に抑制された．したがって，ジクアホソルの水分分泌促進機序にも，結膜細胞の細胞内カルシウムイオンが関与していることが示唆された．以上より，ジクアホソルは，涙腺に対する作用は完全に否定できないものの，おもに結膜上皮細胞膜上のP2Y2受容体に結合し，細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させた結果，細胞膜上のClイオンチャンネルが開口し，Clイオンの輸送に伴い水分の分泌を誘導すると考えられた．本作用機序は，ドライアイの治療に用いられている人工涙液あるいはヒアルロン酸ナトリウム点眼液には認められないものであり，ジクアホソルを主成分とする点眼液は，新規作用機序を有するドライアイ治療薬として，その効果が期待される．文献1）DillyPN：Structureandfunctionofthetearfilm.AdvExpMedBiol350：239-247,19942）高村悦子：ドライアイのオーバービュー．FrontiersinDryEye1：65-68,20063）CrookeA,Guzman-AranguezA,PeralAetal：Nucleotidesinocularsecretions：theirroleinocularphysiology.PharmacolTher119：55-73,20084）PendergastW,YerxaBR,DouglassJG3rdetal：SynthesisandP2Yreceptoractivityofaseriesofuridinedinucleoside5￠-polyphosphates.BioorgMedChemLett22：157-160,20015）YerxaBR,DouglassJG,ElenaPPetal：PotencyanddurationofactionofsyntheticP2Y2receptoragonistsonSchirmerscoresinrabbits.AdvExpMedBiol506：261-265,20026）NakamuraM,TadaY,AkaishiTetal：M3muscarinicreceptormediatesregulationofproteinsecretioninrabbitlacrimalgland.CurrEyeRes16：614-619,19977）KompellaU,KimK,LeeVL：Activechloridetransportinthepigmentedrabbitconjunctiva.CurrEyeRes12：1041-1048,19938）LiY,KuangK,YerxaBetal：Rabbitconjunctivalepitheliumtransportsfluid,andP2Y2receptoragonistsstimulateCl?andfluidsecretion.AmJPhysiolCellPhysiol281：C595-602,20019）FujiharaT,MurakamiT,FujitaHetal：ImprovementofcornealbarrierfunctionbytheP2Y2agonistINS365inaratdryeyemodel.InvestOphthalmolVisSci42：96-100,200110）CowlenMS,ZhangVZ,WarnockLetal：LocalizationofocularP2Y2receptorgeneexpressionbyinsituhybridization.ExpEyeRes77：77-84,200311）CandiaOA,ShiXP,AlvarezLJ：Reductioninwaterpermeability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