《第33回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科31（5）：729.732，2014cウサギ赤血球を用いたベンザルコニウム塩化物の傷害性評価とセリシンによる保護効果長井紀章＊1藤田裕美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室PreventiveEffectofSericinonBenzalkoniumChlorideStimulationofRabbitRedBloodCellsNoriakiNagai1）,HiromiFujita1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）andYoshikazuShimomura2）1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine筆者らはこれまで，点眼用保存剤ベンザルコニウム塩化物（BAC）とセリシンを併用することで，長期連続使用可能で安全な点眼用保存剤になりうることを報告してきた．本研究では，ウサギ赤血球を用いた細胞傷害評価モデルにより，セリシンでBAC細胞傷害軽減効果について検討を行った．BAC単独処理群では，10μg/mlBAC処理で溶血率は90.1％となったが，セリシン添加によりBACの溶血作用は軽減され，10μg/mlBAC溶液に0.5％セリシンを併用処理した際の溶血率は17.5％であった．また，セリシンによるBAC細胞傷害軽減作用は濃度依存的に増加した．これら結果とは異なり，セリシンで30分間前処理したものでは，BAC刺激に伴う溶血に対し保護効果を示さなかった．以上，セリシン併用処理によるBACの細胞傷害抑制機構の一つに，刺激に対する細胞膜保護が起因することを明らかとした．Wepreviouslyreportedthattheadditionofsericindecreasesthecornealdamagecausedbybenzalkoniumchloride（BAC）,andthatapreservativesystemcomprisingBACandsericinprovideseffectivetherapyforpatientsrequiringlong-termeyedroptreatment.Inthepresentstudy,weinvestigatedthepreventiveeffectofsericinonBACstimulationofrabbitredbloodcells.Thehemolysisrateinredbloodcellswas90.1％after10μg/mlBACstimulationfor1h.Weadded0.5％sericintoaffecttherateofhemolysisbyBACstimulation；thehemolysisrateundercombinationtreatmentwith10μg/mlBACand0.5％sericinwas17.5％.Inaddition,thepreventiveeffectofsericinincreasedwithsericinconcentration.Ontheotherhand,thepreventiveeffectagainstBACstimulationwasnotobservedwithsericinpretreatmentfor30min.Theseresultsshowthattheadditionofsericinenhancescellmembranetolerance.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（5）：729.732,2014〕Keywords：セリシン，ベンザルコニウム塩化物，ウサギ赤血球，細胞傷害，保存剤．sericin,benzalkoniumchloride,rabbitredbloodcells,cellstimulation,preservative.はじめに眼科領域における薬物療法の中心は点眼薬である．点眼薬の多くは，全身投与薬としてすでに開発されている薬物を点眼薬として製剤化することで開発されてきた．しかし点眼薬の主成分となる薬物（主剤）のみでは点眼薬は製剤として成り立たず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる1）．したがって製剤学的観点から点眼薬について考える際には，その点眼薬に含まれる添加剤の種類，添加目的（効果），傷害性（副作用）についても常に考慮しなければならない．一般的に点眼薬には保存剤〔ベンザルコニウム塩化物（BAC）など〕，等張化剤（塩化ナトリウム，ホウ酸，グリセリンなど），緩衝剤（リン酸緩衝液，ホウ酸など），また必要であれば，界面活性剤（ポリソルベート80など），安定化剤〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（103）729 〔エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など〕，粘稠化剤〔ポリビニルアルコール（PVA），ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロースなど〕などが含まれる1）．これら添加剤のなかでも保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．特に，BACは眼科領域において代表的な保存剤であり，パラベン類やクロロブタノールなどの他の保存剤と比較し保存効力が高く，水溶性で化学的にも安定であり，扱いやすいことから点眼薬領域の約7割で使用されている2）．しかしながら，BACは細胞傷害性を有し，長期使用により薬剤性角膜上皮傷害がみられることから，近年臨床において問題視されている．このような背景から，点眼回数を減らすなどBAC曝露量を減らすといった試みがなされているが，長期にわたり多剤併用を必要とする眼疾患治療（緑内障など）においては，これらの対策はむずかしいのが現状である3,4）．また，近年ではBACを含有しないポリクォッド（塩化ポリドロニウム）およびSofZia（塩化亜鉛，ホウ酸を含むソルビトール緩衝剤保存システム）をそれぞれ保存剤として用いたデュオトラバRやトラバタンズRのような製剤が開発・市販されているが5），上記保存システムはBACと比較し保存効力が低いため，欧米など日本以外の国々では使用が認可されていないのが現状である．一方，微生物の侵入を防ぐ特殊な容器を使用した保存剤非含有製剤も市販されているが，使用法およびコスト面で問題があるため，BACを基盤とした目に優しい点眼用保存システムの開発が切望されている．筆者らはこれまで，カイコ繭由来の絹タンパク質であるセリシンに注目し，セリシンとBAC併用による点眼用保存システム（BAC/セリシン保存システム）が，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発へ有用であることを報告してきた6）．今回，このBAC/セリシン保存システムの細胞傷害保護機構を明確にすべく，ウサギ赤血球モデルを用い，セリシンのBAC細胞傷害保護効果について検討を行った．I対象および方法1.実験動物実験には2.5.3.0kg日本白色種雌性ウサギを用いた．これらウサギは25℃に保たれた環境下で飼育し，飼料（飼育繁殖固形飼料CR-3，日本クレア）および水は自由に摂取させた．動物実験は，近畿大学実験動物規定に従い行った．2.試薬セリシン（30kDa）はセーレン（株）から供与されたものを用いた．BACおよびヘパリンナトリウムは和光純薬，リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco’sPhosphateBufferedSaline：PBS）はGIBCOから購入したものを用いた．3.ウサギ赤血球標品の調製ウサギ耳静脈より採血した血液1mlと100μlヘパリン730あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014（10mg/ml）を混和後，遠心分離（3,000rpm，37oC，5min）を行った．その後上清を捨て，沈殿とPBSが1：3となるようにPBSを加え，さらに遠心分離（2,000rpm，37oC，5min）を行い，沈殿の回収を行った．これら洗浄操作を2回繰り返したものを赤血球標品として本実験に用いた．陽性対照とした完全溶血赤血球は，精製水2mlに赤血球標品40μlを添加することで作製した．4.浸透圧刺激に伴う溶血率変化の測定上記方法中「3．ウサギ赤血球標品の調製」にて示した赤血球標品40μlを0.1.0.5％セリシン含有または非含有の食塩水（125.215mOsm）2ml中に加え，37oCにて1時間インキュベートを行った．その後，遠心分離（2,300rpm，37oC，5min）にて上清を採取し，576nmにおける吸光度の測定をすることで浸透圧刺激に伴う溶血率変化を示した．また，セリシン前処理時には，赤血球標品を0.1.0.5％セリシン含有または非含有の生理食塩水にて30分間インキュベート後，生理食塩水にて洗浄を行い，上記に示した125.215mOsm食塩水により浸透圧刺激を行った．本研究では，処理後の溶血率（％）を次式（1）により算出した．溶血率（％）＝（試験液吸光度.空試験吸光度）/（陽性対照吸光度.空試験吸光度）×100（1）5.BAC処理に伴う溶血率変化の測定上記方法中「3．ウサギ赤血球標品の調製」にて示した赤血球標品40μlを0.1.0.5％セリシンおよびBAC含有または非含有の生理食塩水（BAC濃度，8.12μg/ml）2ml中に加え，37oCにて1時間インキュベートを行った．その後，遠心分離（2,300rpm，37oC，5min）にて上清を採取し，576nmにおける吸光度の測定をすることでBAC刺激に伴う溶血率変化を示した．また，セリシン前処理時には，赤血球標品を0.1.0.5％セリシン含有または非含有の生理食塩水にて30分間インキュベート後，生理食塩水にて洗浄を行い，上記に示した8.12μg/mlBACにより刺激を行った実験に用いた．処理後の溶血率（％）算出には上記式（1）を用いた．6.統計学的処理実験結果は平均値±標準誤差（SE）で表した．有意差検定はJAMVer.5.1（日本SAS協会）コンピュータプログラムを用いて行った．各々の実験値はDunnettの多群間比較により解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.セリシンによるBAC細胞傷害保護効果図1は浸透圧変化に伴う溶血性変化とセリシンの保護効果を示す．等張時，赤血球の溶血はみられなかったが，浸透圧を下げていくことで溶血が認められた．これら溶血は200mOsm以下でみられ，140mOsmではほぼ完全に溶血した（104） 100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）Osmoticpressure（mOsm）A：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）B：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）Osmoticpressure（mOsm）A：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）B：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Osmoticpressure（mOsm）図1セリシン前処理（A）または併用処理（B）が浸透圧変化による赤血球の溶血へ与える影響平均値±標準誤差，n＝5.6，＊p＜0.05,vs.Saline．（図1A）．一方，セリシンを併用処理することで，これら赤血球溶血の保護効果がみられ，155mOsmの条件下0.5％セリシン併用処理群の溶血率は16.3％であり，非処理群と比較し有意に低値を示した（図1B）．図2はBAC刺激に伴う溶血性変化とセリシンの保護効果を示す．BAC刺激により溶血が認められ，8μg/mlBAC刺激による溶血率は23.3％，10μg/mlBAC刺激では90.1％であった．セリシン併用処理はBAC刺激に対しても細胞傷害保護効果を示し，8μg/mlBAC刺激時では溶血はほとんど認められず，10μg/mlBAC刺激時における非処理群のそれの17.5％であった．また，浸透圧変化およびBAC刺激時におけるセリシンの保護効果は濃度依存的であった．これらセリシン併用処理実験の結果とは異なり，セリシンを30分間前処理したものでは，浸透圧およびBAC刺激に伴う溶血に対し保護効果を示さず，今回用いたいずれの濃度においても，溶血挙動に差はみられなかった（図1Aおよび図2A）．III考按セリシンは，絹糸原糸タンパク質の約20％を占める主要成分である．従来，セリシンは絹糸精製（精練）段階で廃棄されてきた物質であったが，保湿性や抗酸化能をもつことが明らかとなり，近年では産業資材や化粧品などに利用されて（105）100806040200Hemolyticratio（%）A：Saline■：0.1%sericin■：0.25%sericin■：0.5%sericin89101112BACconcentration（mg/ml）10080604020089101112Hemolyticratio（%）B：Saline■：0.1%sericin■：0.25%sericin■：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊BACconcentration（mg/ml）図2セリシン前処理（A）または併用処理（B）がBAC刺激による赤血球の溶血へ与える影響平均値±標準誤差，n＝5.8，＊p＜0.05,vs.Saline．いる7）．また，皮膚炎などのアレルギー防止作用を有することも見出され，生物化学領域においても注目されている8,9）．筆者らもこれまで，このセリシン溶液点眼により角膜傷害治癒促進効果がみられ，1.5％のセリシン溶液が角膜傷害治療薬として有用であることを見出してきた10）．さらに，BACとセリシン併用によりBACの角膜傷害性が緩和され，0.1％のセリシンを用いることで，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発に繋がる可能性を報告してきた6）．本研究では，点眼用保存剤BACとこのセリシンからなるBAC-セリシン点眼用保存システムの開発研究として，ウサギ赤血球モデルを用い，セリシンのBAC細胞傷害保護効果について検討を行った．赤血球は，両面中央が凹んだ円盤状の形をしており，核を持たないことから細胞分裂などを行わないのが特徴である．このため，赤血球を用いることで，薬剤自身の直接的な刺激性やそれに対する保護作用の評価が可能である．そこで今回，この赤血球モデルを用いて浸透圧およびBAC刺激に対するセリシンの細胞保護効果を評価した．まず，浸透圧刺激に対するセリシンの細胞保護効果を検討したところ，等張時，赤血球の溶血はみられなかったが，浸透圧を下げていくことで溶血が認められた．また，セリシンを併用処理することで，赤血球溶血の保護効果がみられ，これら保護効果は濃あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014731 度依存的であった．点眼用保存剤として用いられるBAC刺激に対するセリシンの細胞保護効果を検討したところ，本実験条件において，7μg/ml以上のBAC刺激により溶血が認められ，8μg/mlBAC刺激時の溶血率は23.3％，10μg/mlBAC刺激では90.1％の溶血率であった．さらに，浸透圧刺激と同様，セリシン併用処理はBAC刺激に対しても細胞傷害保護効果を示し，8μg/mlBAC刺激時では溶血はほとんど認められず，10μg/mlBAC刺激では非処理群のそれの17.5％であった．また，BAC刺激に対してもセリシンによる保護効果は濃度依存的であった．これらの結果から，セリシンはBACだけでなく，浸透圧などの外部刺激に対しても細胞保護効果を有し，併用処理により細胞傷害を有する点眼製剤の毒性軽減に有用であることが示唆された．一方，セリシンを前処理した際には，浸透圧およびBAC刺激に対するセリシンの保護効果はみられず，セリシン前処理群と未処理群間で浸透圧，BAC刺激に対し同様の溶血性を示した．これら前処理によりセリシンの細胞保護効果が得られなかった理由として，セリシンによる保護効果が細胞膜の活性化によるものではなく，刺激因子に対する直接的な抵抗性増加に起因するためと考えられた．筆者らはこれまで，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発を目指した研究にて，invivoおよびinvitro細胞傷害性評価実験系を確立し11,12），BACへのセリシン添加が，BAC本来の使用目的である保存効果，主薬の角膜透過性亢進能および主薬の薬効に対し影響を及ぼさないことを報告してきた6）．これら以前および今回の結果から，BAC/セリシン点眼用保存システムはBACの角膜上皮傷害性を抑制するとともに，点眼用保存剤として十分な高い保存効力を有し，主成分の角膜透過性および薬効に影響を及ぼさず，またBACの細胞傷害抑制機構の一つに，セリシンの膜保護能が関わっているものと考えられた．本報告は目に優しく長期連続使用可能な保存剤を開発するうえで有用であるものと考えられる．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）川嶋洋一：点眼薬の設計思想．眼科NewInsight第2巻点眼薬─常識と非常識─（木下茂ほか）．p6，メジカルビュー社，19942）WhitsonJT,VarnerDL,NetlandPA：Glaucomadrugsandtheocularsurface.RevOphthalmol11：69-77,20063）PisellaPJ,PouliquenP,BaudouinC：Prevalenceofocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservativefreeglaucomamedication.BrJOphthalmol86：418-423,20024）JaenenN,BaudouinC,PouliquenPetal：Ocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservative-freeglaucomamedications.EurJOphthalmol17：341-349,20075）湖崎惇，大谷伸一郎，鵜木一彦ほか：トラボプロスト点眼液の臨床使用成績眼表面への影響．あたらしい眼科26：101-104,20096）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Decreaseincornealdamageduetobenzalkoniumchloridebytheadditionofsericinintotimololmaleateeyedrops.JOleoSci62：159166,20137）DashR,AcharyaC,BinduPCetal：Antioxidantpotentialofsilkproteinsericinagainsthydrogenperoxide-inducedoxidativestressinskinfibroblasts.BMBRep41：236241,20088）TsubouchiK,IgarashiY,TakasuYetal：Sericinenhancesattachmentofculturedhumanskinfibroblasts.BiosciBiotechnolBiochem69：403-405,20059）TeradaS,NishimuraT,SasakiMetal：Sericin,aproteinderivedfromsilkworms,acceleratestheproliferationofseveralmammaliancelllinesincludingahybridoma.Cytotechnology40：3-12,200210）NagaiN,MuraoT,ItoYetal：EnhancingeffectsofsericinoncornealwoundhealinginOtsukaLong-EvansTokushimaFattyratsasamodelofhumantype2diabetes.BiolPharmBull32：1594-1599,200911）NagaiN,MuraoT,OeKetal：Invitroevaluationforcornealdamagesbyanti-glaucomacombinationeyedropsusinghumancornealepithelialcell（HCE-T）.YakugakuZasshi131：985-991,201112）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,2010＊＊＊732あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014（106）