《第7回日本涙道・涙液学会原著》あたらしい眼科36（9）：1183.1187，2019c涙小管結石の組成についての検討─細菌学的検査，組織化学的および元素分析的解析児玉俊夫＊1大城由美＊2首藤政親＊3＊1松山赤十字病院眼科＊2松山赤十字病院病理診断科＊3愛媛大学学術支援センターCAnalysisofConcretionintheCanaliculus─Microbiological,HistochemicalandElementAnalysisToshioKodama1），YumiOshiro2）andMasachikaShudo3）1）DepartmentofOphthalmology,MatsuyamaRedCrossHospital,2）3）IntegratedCenterforScience,EhimeUniversityCDepartmentofPathology,MatsuyamaRedCrossHospital,目的：細菌学的，組織学的検査および元素分析による涙小管結石の解析．対象および方法：対象は涙小管結石を摘出したC22例で，膿性分泌物の好気性，嫌気性細菌培養を行った．摘出された結石はグラム染色，コッサ染色，過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色による組織化学的解析，走査型電子顕微鏡（SEM）による微細構造の検討，およびエネルギー分散型蛍光CX線分析による構成元素の解析を行った．結果：細菌学的検査で放線菌が検出できたのはC22例中C6例で，病理組織標本では菌糸を有すグラム陽性桿菌がC15例で認められた．結石の中心部は好酸性の無構造物質がみられ，PAS陽性のムコ多糖類が層状構造を示し，塊状のカルシウム沈着がみられた．SEMにより結石の表面にはフィラメント様線維がみられ，元素分析により結石表面の主要な元素として炭素，塩素，酸素，リン，カルシウムが認められた．結論：涙小管結石は肉芽腫から漏出したムコ多糖類などが放線菌菌糸に絡みつき，さらにカルシウムが沈着することにより涙小管結石を形成したと考えられた．CPurpose：Toreportthecharacteristicsofmicrobiological,histochemicalandelementanalysisofconcretioninthecanaliculus.Methods：Thisstudywasconductedon22casesoflacrimalcanaliculitiswhounderwentsurgicalremovalCofCconcretions.CPurulentCdischargeCwasCexaminedCbyCaerobicCandCanaerobicCcultures.CConcretionsCwereCexaminedusinghistopathologicalstainingwithhematoxylinandeosin,gram,Kossaandperiodicacid-Schi.（PAS）C.Westudiedtheconcretionsurfacebyobservationwithscanningelectronmicroscopy（SEM）andenergydispersiveX-rayCspectrometry（EDX）C.CResults：InCbacteriologicalCexamination,CpurulentCdischargeCshowedCActinomycesCin6outCofC22Ccases.CHistopathologicalCexaminationCrevealedC15CcasesCofC.lamentousCgram-positiveCorganisms.CEosino-philicCamorphousCmatrixCwasCobservedcentrally；PAS-positiveCmucopeptideCmaterialsCshowingClaminarCstructureCandcalciumdepositionwerescatteredintheconcretions.SEMshowed.lamentousorganismsonthesurfaceoftheconcretion,CtheCfrequentCelementsCbeingCcarbon,Cchlorine,Coxygen,Cphosphorous,CcalciumCasCdemonstratedCbyCEDX.CConclusion：Wesupposeaconcretiondevelopmentalprocessinwhichmucopeptidesecretedfromgranulationtis-suesinthecanaliculitismayconglutinatetothe.lamentousgram-positiveorganismsandthatcalciumdepositionmayfollow.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）C36（9）：1183.1187,C2019〕Keywords：涙小管炎，涙小管結石，放線菌，石灰化，エネルギー分散型CX線分析．lacrimalcanaliculitis,concre-tioninthecanaliculus,Actinomyces,calci.cation,energydispersiveX-rayspectrometry.C〔別刷請求先〕児玉俊夫：〒790-8524愛媛県松山市文京町1松山赤十字病院眼科Reprintrequests：ToshioKodama,M.D.,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,MatsuyamaRedCrossHospital,1Bunkyo-cho,Matsuyama,Ehime790-8524,JAPANCはじめに涙小管炎は比較的まれな疾患で，亀井らによると抗菌点眼薬では改善しない片眼性の難治性結膜炎として治療されていることが多く，涙点の拡大や涙小管部の眼瞼腫脹あるいは硬結，および大量の粘液膿性眼脂などの臨床症状がみられる1）．涙小管炎には菌塊ともよばれる涙小管結石を生じることがあるが，なぜ涙小管炎に結石形成がみられるのか，その異所性石灰沈着の機序はいまだ明らかではない．本報告では手術によって摘出した涙小管結石について細菌学的検査，組織化学的解析，走査型電子顕微鏡および元素分析を行って結石の石灰化メカニズムについて検討したので報告する．CI対象および方法対象はC2004年4月1日.2019年1月C31日の14年10カ月間に松山赤十字病院眼科（以下，当科）において手術により涙小管結石を摘出したC22例である．涙小管炎の起炎微生物の同定については，涙点部の圧迫を行って排出された膿性分泌物を用いて塗抹標本のグラム染色と細菌培養を行った．培養条件として好気性菌および通性嫌気性菌検出のための好気的培養は大気中で行った．偏性嫌気性菌検出のための嫌気的培養は試料を採取して即座に当科と同じ階にある微生物検査室に運び，窒素C80％，水素C10％，二酸化炭素C10％の混合ガスに満たされたグローブ付きボックスの中で培養を行った．涙小管結石は，涙点拡張後に鋭匙により炎症を生じている涙小管内を掻爬するか，涙小管を切開して周囲の肉芽組織とともに採取した（図1）．なお，涙小管の再建のため涙小管切開後，涙管チューブを留置して涙小管断端同士を縫合した．涙管チューブは涙管通水試験で涙小管が閉鎖していないことを確認して約C3カ月後に抜去した．図1涙小管切開による涙小管結石の摘出下涙小管部で硬結を触れる部位で皮膚切開を加え，結石（.）と周囲の肉芽組織を露出した．摘出した涙小管結石はホルマリン固定，アルコール脱水，パラフィン包埋を行ってC3Cμmの薄切切片を作製した．薄切切片はヘマトキシリン・エオジン（HE）染色，グラム染色，カルシウム染色であるコッサ染色，ムコ多糖類の染色である過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色を行い，結石の性状について検討した．涙小管結石表面の微細構造の解析は，摘出した結石をC3％グルタールアルデヒド・リン酸緩衝液で固定後，臨界点乾燥を行って走査型電子顕微鏡（SEM）で観察し，さらにエネルギー分散型CX線分析（energyCdispersiveCX-rayspectrometry：EDX）により結石表層の構成元素を特定した．涙小管結石のおもな構成元素のピーク高と涙.鼻腔吻合術で切除した前涙.稜の骨組織の構成元素と比較した．本研究は松山赤十字病院医療倫理委員会の承認を受けて行った（NoC657）．CII結果涙小管結石を摘出した患者の平均年齢はC72.7C±9.2歳（平均±標準偏差，57.87歳）で男性C5例，女性C17例と女性に多かった（図2）．膿性分泌物の細菌学的検査を行ったC22例中，放線菌が分離されたのはC6例で，そのうちCActinomycesisraeliiと同定できたのはC2例のみであった．放線菌以外の検出菌はC52株で，好気性菌および通性嫌気性菌では多い順にCStreptococ-cusanginosusが8株，Corynebacterium属とCStapylococcusepidermidisが5株，StapylococcusaureusがC4株であった．偏性嫌気性菌ではCPropionibacteriumacnesが9株，Fusa-bacterium属がC3株であった．細菌培養により放線菌が検出できなかったC16症例では摘出した結石のパラフィン切片を用いて病理組織検査を行った．グラム染色で結石の表層に放線菌と考えられる菌糸を有すグラム陽性桿菌が認められたのはC15例であった．残りC1例では菌糸の直径がC2Cμmを超えており放線菌より直径が大きいために，真菌染色であるグロコット染色を行って真菌と確認した．（例）181614121086420男性女性図2性別による涙小管炎の頻度結石を伴う涙小管炎の頻度は女性に多かった．図3涙小管結石の組織化学的所見a：HE染色．結石の表層には炎症細胞浸潤がみられ，結石の中心部は好酸性の無構造物質が存在していた．バーはC10Cμm．Cb：PAS染色．結石内部にはCPAS陽性のムコ多糖類からなる物質が層状構造（.）をとっていた．C→はCcにおける塊状の石灰化物で，PAS染色標本でもみられた．バーはC10Cμm．Cc：コッサ染色．結石内に塊状の石灰化物（C→）がみられ，その付近に微小な石灰沈着が認められた（⇒）．バーはC10Cμm．Cd：グラム染色．結石の表層部に菌糸を有するグラム陽性桿菌（☆）が多数認められた．バーはC10Cμm．図4涙小管結石の微細構造a：グラム染色．フィラメント状の菌糸を有するグラム陽性桿菌が多数みられ放線菌と考えた．バーは1Cμm．Cb：SEM．析出した線維素あるいは菌糸と考えられる微細なフィラメント状物質と，桿菌と思われる長さ1.2Cμmの菌体類似構造（.）が認められた．バーはC10Cμm．つぎに涙小管結石の性状を明らかにするために組織化学的な石灰沈着が認められた（図3c）．グラム染色では結石の表検討を行った．HE染色において最表層には炎症細胞浸潤が層部に菌糸を有するグラム陽性桿菌が多数認められた（図みられ，結石の中心部は好酸性の無構造物質が存在していたC3d）．さらにグラム染色標本のグラム陽性桿菌は，高倍率で（図3a）．PAS染色では結石内部にCPAS陽性のムコ多糖類詳細を観察するとフィラメント状の菌糸を有しており，放線から成り立つ物質が層状構造をとっていた（図3b）．コッサ菌と考えた（図4a）染色では結石内に塊状の石灰化物がみられ，その周囲に微小SEMにより結石表面の微細構造を観察すると，析出したab図5涙小管結石と骨組織表面のEDXの比較a：涙小管結石（90歳，女性）．Cb：骨組織（71歳，女性）．涙.鼻腔吻合術時に切除した前涙.稜の骨壁．EDXによる分析では，涙小管結石の表層のおもな元素は炭素，塩素，酸素，リン，カルシウムで，骨組織も同様であった．涙小管結石では骨組織と比較するとリン（①）のピークが高く，塩素（②）とカルシウム（③）のピークが減少していた．線維素あるいは菌糸と考えることもできる微細なフィラメント状物質と桿菌と思われる長さC1.2Cμmの菌体類似構造が認められた（図4b）．同部位をCEDXにより計測して結石表層の構成元素を分析したところ，炭素，塩素，酸素，リン，カルシウムが結石表層の構成元素として同定された．比較のため涙.鼻腔吻合術で切除した骨組織を分析したところ，結石の構成元素と同様の組成を示した．今回使用したCEDXでは定量的測定ができないためにピーク高での単純比較しかできないが，涙小管結石では骨組織と比較するとリンのピークが高く，塩素とカルシウムのピークが減少していた（図5）．CIII考按涙小管炎は比較的まれな疾患であるが，抗菌点眼薬では改善しない膿性の眼脂を伴った片眼性の難治性結膜炎をみたら涙小管炎を鑑別診断にあげる必要がある．臨床所見として噴火状に突出した涙点を中心に眼瞼の発赤を認め，圧迫すると膿が排出される．起炎病原微生物の同定には細菌培養検査が不可欠であるが，起炎菌としてグラム陽性嫌気性菌である放線菌の検出率は低い．膿性分泌物を用いた嫌気培養による放線菌の検出率を比較すると，DemantらはC12例中C3例（25％）2），亀山らはC32例中C12例（38％）1）とその検出率は高いとはいえない．本報告でもその検出率はC27％であった．そのため亀山らやCVeirsは細菌培養による検出が放線菌の診断には必要ではなく，塗抹標本で菌糸を有すグラム陽性桿菌が証明されれば涙小管放線菌症と診断可能としている1,3）．本報告では涙小管結石C16例のパラフィン切片を作製して，グラム染色を行い結石の表層に放線菌と考えられる菌糸を有すグラム陽性桿菌が検出できたのはC15例であった．Reppらはフィラメント様構造物がより明瞭に染色できるゴモリ・メセナミン銀溶液を用いて涙小管結石C11例を染色したところ放線菌の菌糸を検出できたのはC10例で，病理組織化学的手法が放線菌の検出に有用としている4）．涙小管結石は硬度が低くもろいために結石を押しつぶして塗抹標本を作製することがあるが，手間はかかっても結石をホルマリン固定，パラフィン切片を作製してグラム染色を行ったほうが微生物の形状が保たれるために放線菌の検出には有利である5）．問題点として塗抹標本および病理組織標本ともフィラメント状の菌糸をもつグラム陽性桿菌である放線菌目の細菌を検出できても，嫌気性のアクチノミセス属か好気性のノカルジア属かを同定することは不可能であり，やはり菌種の同定には細菌培養検査が不可欠である6）．なぜ放線菌の検出率が低いか，その理由を考えてみたい．膿性分泌物の細菌学的検査による放線菌以外のおもな検出菌は，好気性および通性嫌気性菌ではCStreptococcusanginosus，Corynebacterium属，StapylococcusCepidermidis，Stapylococ-cusaureusの順に多かった．偏性嫌気性菌ではCPropionibac-teriumacnesとCFusabacterium属が多かった．Stapylococcusepidermidis，Stapylococcusaureus，Corynebacterium属細菌は結膜.常在細菌叢を形成しており，Propionibacteriumacnesはマイボーム腺や皮膚の毛根部に生息している7）．一方，口腔内にも多数の微生物が生息しており放線菌，StreptococcusanginosusやCFusabacterium属細菌は口腔内細菌叢の一員として定住している8）．これらの常在菌が混在していると発育の遅い放線菌の生育が抑制されるために細菌培養での検出率が低下すると考えられる．涙道結石の形成機序について，Iliadelisらは炎症の起きている涙道粘膜において涙液の再吸収が生じて塩類，とくにカルシウムの過飽和が生じることにより結石形成が促進されるとしている．さらに高濃度の塩類は水可溶性蛋白質の凝集をもたらし，その結果，変性した蛋白質が結石の核になりうるという仮説を提唱している9）．この仮説を踏まえたうえで，結石形成のメカニズムを本報告では組織化学的および電子顕微鏡的に検討した．結石の中心部はCHE染色にて好酸性の無構造物質で，凝集した変性蛋白質と考えることができる．PAS染色ではCPAS陽性のムコ多糖類が凝集して層状構造を示しており，少しずつ凝集して結石を形成したと考えられる．同時に結石内部の放線菌の菌体は吸収されて無構造化したと思われる．結石の表層ではコッサ染色で示されたカルシウム沈着が認められ，グラム染色で放線菌が同様に結石の表層に分布していたことを考えると，放線菌と石灰沈着の間には何らかの関連があると思われる．Perryらは涙道結石をムコペプチド型と細菌型のC2種類に分類し，ムコペプチド型結石は涙.に局在し，細菌型結石は大多数が涙小管から採取されたと報告し，細菌型結石ではカルシウムの含有量が少ないために石のような硬度を示すことはまれであるとしている10）．本報告でも涙小管結石C16例中C15例に放線菌が検出され，涙小管結石は放線菌が増殖した細菌型の結石に分類される．涙小管炎は女性に多いという特徴があるが，本報告でも男性C5例に対して女性はC17例と女性に発症することが多いことがわかった．前述のように結石形成は核となる物質が存在すれば，結石の成長が促進される．すなわち，女性では化粧品のパウダーが涙小管に貯留するために涙小管結石の核となるというメカニズムも考えられている11）．EDXによる分析では涙小管結石の表層は炭素，塩素，酸素，リン，カルシウムで構成されていたが，いずれもカルシウム塩の構成元素である．今回使用したCEDXでは定量的分析は困難である12）が，涙.鼻腔吻合術時に切除された骨組織の構成元素を強度で比較すると，涙小管結石ではリンの量が高かったが，塩素とカルシウムの量が多かった理由として，涙小管結石でカルシウム量が少なく，リンの量が高かったのは骨組織に比較すると涙小管結石では骨密度が低く，蛋白質などの有機物の量が多いためと考えられる．組織学的検討より涙小管結石はCPerryらが提唱した涙道結石の分類では細菌型の特徴を備えていたが，EDXの結果もこの所見を支持するものである．涙小管結石の生成機序として涙小管炎に伴う肉芽腫血管から漏出したムコ多糖類や，おそらく結膜杯細胞由来のムチンなどが放線菌の菌糸に絡みついてバイオフィルムを形成し，さらにカルシウムが沈着することにより涙小管結石を形成したと考える．文献1）亀井和子，中川尚，内田幸男：放線菌による涙小管炎の臨床所見．あたらしい眼科7：1783-1786,C19902）DemantCE,CHurwitzJ：Canaliculitis：ReviewCofC12Ccases.CCanJOphthalmolC15：73-75,C19803）VeirsER：TheClacrimalCsystem.Canaliculus.：In：Exter-naldiseasesoftheeye（WilsonLA,ed）C.p134-138,Harper&Row,Hagerstown,19794）ReppCDJ,CBurkatCCN,CLucarelliMJ：LacrimalCexcretoryCsystemconcreations：canalicularCandClacrimalCsac.COph-thalmologyC116：2230-2235,C20095）石川和郎，児玉俊夫，島村一郎ほか：菌塊を形成した涙小管感染症の細菌学的検討．臨眼62：467-472,C20086）水口康雄：アクチノミセス，ノカルジア．戸田新細菌学改訂32版（吉田眞一，柳雄介編），p669-673，南山堂，20027）桑原知巳：結膜.常在細菌叢．眼科58：157-165,C20168）中山浩次：口腔微生物と感染症．戸田新細菌学改訂C32版（吉田眞一，柳雄介編），p178-180，南山堂，20029）IliadelisCED,CKarabatakisCVE,CSofoniouMK：DacryolithsCinCaCseriesCofdacryocystorhinostomies：HistologicCandCchemicalanalysis.EurJOphthalmolC16：657-662,C200610）PerryCLJP,CJakobiecCFA,CZakkaFR：BacterialCandCmuco-peptideCconcretionsCofCtheClacrimaldrainageCsystem：AnCanalysisof30cases.OphthalPlastRecostrSurgC28：126-133,C201211）MarthinJK,LindegaardJ,PrauseJUetal：LesionsofthelacrimaldrainageCsystem：aCclinicopathlogicalCstudyCofC643CbiopsyCspecimensCofCtheClacrimalCdrainageCsystemCinCDenmarkC1910-1999.CActaCOphthalmolCScandC83：94-99,C200512）星野玲子：蛍光CX線分析の原理と機器を利用した比較研究．鶴見大学紀要52：77-89,C2015＊＊＊