《原著》あたらしい眼科30（11）：1623.1627，2013c卵巣摘出ラットへの低カルシウム食投与による角膜上皮傷害治癒速度の遅延長井紀章緒方文彦船上仁範伊藤吉將川﨑直人近畿大学薬学部CornealWoundHealingRateDelayinOvariectomizedRatsReceivingLow-calciumDietNoriakiNagai，FumihikoOgata,YoshinoriFunakami,YoshimasaItoandNaohitoKawasakiFacultyofPharmacy,KinkiUniversity加齢に伴う全身性機能の変化が視覚（眼領域）へ及ぼす影響を明確にすることは，超高齢化社会を迎えるわが国において非常に重要である．本研究では，閉経後のカルシウム不足と角膜上皮傷害の自己修復機能の関係を明らかとすべく，卵巣摘出ラットへの低カルシウム食投与時における角膜上皮傷害治癒速度について検討を行った．1カ月間の低カルシウム食（低カルシウム飼料および精製水）投与は体重，飼料摂取量および飲水量に影響を与えなかったが，血中および骨中カルシウム量の低下がみられた．また，これらカルシウム欠乏ラットの角膜上皮を.離し，一次速度式にて角膜傷害治癒速度定数を算出したところ，正常ラットと比較し，角膜傷害治癒速度定数が有意に低値を示した．以上，本研究では卵巣摘出モデルを用いたinvivo実験において，低カルシウム食摂取時には角膜傷害治癒速度が低下することを明らかとした．InJapan,anagingsociety,itisimportanttoclarifyage-relatedfunctionaldisordersorchangesinophthalmology.Inthisstudy,weinvestigatedtherelationshipbetweencalciumdeficiencyandcornealwoundhealing,usingovariectomizedratsthatreceivedalow-calciumdiet.Thelow-calciumdietdidnotaffecttherats’bodyweight,butthecalciumcontentoftheirserumandboneclearlydecreasedafter1monthofthelow-calciumdiet.Inaddition,thecornealwoundhealingratewassignificantlylowerintheovariectomizedratonthelow-calciumdietthaninnormalrat.Inadditiontosuggestingthatcalciumdeficiencyinmenopausecancausedelayincornealwoundhealing,thesefindingprovidesignificantinformationforuseindesigningfurtherstudiesaimedatremainingthequalityofvision.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）30（11）：1623.1627,2013〕Keywords：低カルシウム食，角膜傷害治癒，卵巣摘出ラット，カルシウム量，コントレックス．low-calciumdiet,cornealwoundhealing,ovariectomizedrat,calciumcontent,contrex.はじめに眼はヒトが外界の情報を得るうえで最も活躍する器官であり（その割合は80％以上），qualityofvision（QOV）の保証はqualityoflife（QOL）の向上・維持において不可欠である．角膜はこの眼組織の中で最も外側に位置し，涙液を介して外界と直接接する部位であることから，外傷や感染症をはじめとする種々の外的要因により傷害を受けやすい部位でもある．正常な角膜上皮細胞は細胞伸展能や細胞増殖能を有しており，軽度な上皮傷害は速やかに自己修復される．しかし，重篤な上皮傷害で上皮細胞の機能が低下している場合や涙液に異常のある場合（ドライアイ）などでは，しばしば遷延化して点眼療法による回復が困難となる．また，長期点眼療法も，角膜の障害をひき起こす大きな要因（薬剤性角膜症）である．これら薬剤性角膜症は，患者からのしみる，かすむ，眼が充血するといった訴えで点眼薬の中止および変更を余儀なくされるとともに，重篤な角膜傷害による視力低下につながる．一方，角膜は外部の情報を取り込むという性質上透明であり，栄養を得るための血管を有しておらず，涙液および〔別刷請求先〕長井紀章：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：NoriakiNagai,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/13/\100/頁/JCOPY（131）1623 房水から栄養が供給される．このような背景から，加齢に伴う全身性の身体変化や機能変化は，角膜治癒能や傷害能にも影響を与えることが予想されるが，これらの検討については十分になされていないのが現状である．閉経は，40.50歳代以降に女性にみられる加齢に伴う代表的な身体変化であり，閉経後にはホルモンバランスの崩壊による基礎代謝機能の低下がみられる．また，エストロゲン欠乏により破骨細胞の骨吸収が亢進されるなど，閉経前とは体内のカルシウム制御が異なることが知られている．さらに，国民健康・栄養調査の結果では，閉経後女性の平均カルシウム摂取量は平均必要推奨量に達していない1,2）．これらの背景から，超高齢化社会に突入しているわが国では，カルシウム不足と健康の関係について社会的関心が高まりつつある．本研究では，この加齢に伴う代表的身体および機能変化を伴う閉経後のカルシウム不足と角膜上皮傷害の自己修復機能の関係を明らかとすべく，卵巣摘出ラットへの低カルシウム食投与による角膜上皮傷害治癒速度の変化について検討を行った．I対象および方法1.実験動物卵巣を摘出した5週齢Wistar雌性ラット（清水実験材料，京都）を購入し，飼育繁殖固形飼料CE-2（日本クレア，大阪）および水道水により1週間順化させた後，6週齢（対象群，Control群）で実験に用いた．動物は，順化後無作為に2群に分け，低カルシウム飼料および精製水（PW群），または低カルシウム飼料および市販コントレックスR（Contrex群）を1カ月間給餌した．低カルシウム飼料はAUN-93G組成を基本として調製し，その組成は51.9％コーンスターチ，20％ミルクカゼイン，10％グラニュー糖，7％精製大豆油，5％結晶セルロース，3.5％ミネラルMix，1％aコーンスターチ，1％ビタミンMix（AIN-93VX），0.3％L-シスチン，0.25％重酒石酸コリンおよび0.0014％第3ブチルヒドロキノン（最終Ca含有濃度0.006％）であり，コントレックスRの組成はカルシウム0.0468％，ナトリウム0.00094％，マグネシウム0.00745％，サルフェート0.1121％，熱量0kcal，蛋白質・脂質・炭水化物0％のものを用いた．これらラットは25℃に保たれた環境下で飼育し，飼料および水は自由に摂取させた．動物実験は，近畿大学実験動物規定に従い行った．2.試薬生検トレパンはカイインダストリーズ，ブレード（BDMicro-SharpTM，Blade3.5mm，30°）はBectonDickinson，塩酸オキシブプロカイン（ベノキシールR）は参天製薬，フルオレセインは日本アルコンから購入したものを用いた．1624あたらしい眼科Vol.30，No.11，20133.血中および骨中カルシウム量の測定ペントバルビタールナトリウム（30mg/kg，i.p.,東京化成株式会社，東京）投与にて全身麻酔後，ラット大静脈から採血し，その後，さらにペントバルビタールナトリウムを過剰投与することで安楽死させ，大腿骨の採取を行った．血清は，得られた血液をヘパリンとともに遠心分離（15,000rpm，4oC，15min）することで得た．血清中カルシウム濃度は，得られた血清を1％硝酸で適宜希釈し，誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ICP-AES,株式会社島津製作所，京都）においてカルシウム濃度を測定した．ラット大腿骨は2時間煮沸後，自然乾燥した．その後，マッフル炉において2時間昇温，48時間保持（550oC），自然冷却することにより実験に供した．収率は，灰化前後における重量差から算出した（Control群59.6±0.3，PW群50.1±0.9，Contrex群55.4±0.6％，平均値±標準誤差，n＝3）．灰化後の大腿骨は，1％硝酸50mlに完全溶解し，適宜希釈し，ICP-AESにおいてカルシウム濃度を測定した．4.ラット角膜上皮.離モデルを用いた角膜傷害治癒解析ラットをペントバルビタールナトリウム（30mg/kg,i.p.）にて全身麻酔後，生検トレパンで直径2.5mmの円形に角膜をマーキングした．その後，ブレードで角膜上皮を円形に.離した．角膜上皮欠損部分は角膜.離後0，12，24，36時間後に，1％フルオレセイン含有0.4％ベノキシール点眼液にて染色し，トプコン社製眼底カメラ装置TRC-50Xにデジタルカメラを装着したものを用いて撮影を行い，画像解析ソフトImageJにて角膜上皮欠損部分の面積の推移を数値化することで表した．角膜傷害治癒率（％）は，次式（1）にて算出した3）．角膜傷害治癒率（％）＝（面積.離直後.面積.離0.36時間後）/面積.離直後×100（1）角膜傷害治癒速度は，角膜傷害治癒速度定数（kH,hr.1）として表した．角膜上皮.離0.36時間後のkHは，次式（2）および非線形最小二乗法プログラムMULTIにて計算した3）．Ht＝H∞・（1.e.kH・t）（2）tは角膜上皮.離後の時間（0.36時間），H∞およびHtは角膜上皮.離∞およびt時間後の角膜傷害治癒率を示す．これら式（2）は単位時間当たりの「角膜傷害治癒率」の改善率（＝kH,kH＞0）が一定であるという仮定の下に成立する式であり，本研究結果は式（2）に適応可能であった．5.統計解析データは，平均±標準誤差として表した．有意差はStudent’st-testにて解析し，0.05未満のp値を有意な差として示した．II結果表1には実験開始前（順化後）の卵巣摘出ラット（Control（132） 群）における体重，血中，骨中カルシウム量および角膜傷害群ではControl群およびContrex群と比較し，血中および骨治癒速度（kH）を，表2には低カルシウム食（低カルシウム中カルシウム量が有意に低値を示した．図1には低カルシウ飼料および精製水または市販コントレックスR）摂取時におム食摂取ラットにおける角膜上皮.離後の代表的写真（A）けるラット体重，飼料摂取量，飲水量，血中・骨中カルシウおよび角膜傷害治癒率（B）を示す．Control群の角膜傷害治ム量およびkHを示す．PWおよびContrex群いずれにおい癒率は，.離12時間後において52.1±3.6％であり，.離ても体重，飼料摂取量および飲水量に差はみられなく，対象36時間後ではほぼ完全に治癒した（平均値±標準誤差，n＝としたControl群と比較しその値は高まっていた．また，3）．またContrex群の角膜傷害治癒率は，Control群と類似Contrex群の血中および骨中カルシウム量もControl群と同しており，kHも同程度であった（表2）．一方，PW群では程度であった．これらContrex群の結果とは異なり，PW角膜傷害治癒が有意に遅延し，.離12時間後における角膜表16週齢卵巣摘出ラット（Control群）における体重，血中・骨中カルシウム量および角膜傷害治癒速度BodyweightFoodintakeWaterconsumedSerumCaBoneCakH（g）（g/day/rat）（ml/day/rat）（mg/l）（g/g）（×10.2/hr）Control群253.3±3.320.4±0.623.3±1.7145.2±3.00.54±0.015.30±1.49平均値±標準誤差，n＝3．表2低カルシウム食摂取が血中・骨中カルシウム量および角膜傷害治癒速度へ与える影響Bodyweight（g）Foodintake（g/day/rat）Waterconsumed（ml/day/rat）SerumCa（mg/l）BoneCa（g/g）kH（×10.2/hr）276.7±14.521.1±4.824.4±0.6131.6±6.70.46±0.010.91±1.13276.7±12.021.7±2.524.4±1.1165.8±6.4＊0.53±0.01＊5.26±1.41＊PW：低Ca飼料およびPW摂取ラット，Contrex：低Ca飼料およびコントレックスR摂取ラット．平均値±標準誤差，n＝3．＊p＜0.05,vs.PW．図1低カルシウム食投与が角膜上皮傷害治癒へ与える影響低カルシウム飼料およびPW（PW群）またはコントレックスR（Contrex群）は卵巣摘出後，1カ月間自由摂取により与えた．また，角膜傷害治癒率は式（1）を用いて算出した．A：代表的画像（点線内は傷害部をContrex群12h24h36h0h122436時間（h）020406080100：PW群：Contrex群＊＊＊BPW群Contrex群APW群角膜傷害治癒率（%）示す），B：角膜上皮傷害治癒率．平均値±標準誤差．n＝3，＊p＜0.05,vs.PW群．（133）あたらしい眼科Vol.30，No.11，20131625 傷害治癒率はContrex群の約63％であり，.離36時間後においても傷害が認められた．PW群およびContrex群のH∞は類似しており，それぞれ100.2±4.9％，101.4±6.7（平均値±標準誤差，n＝3）であった．III考按角膜は視覚に関わる器官であり，この角膜の状態を維持することは，QOLの向上に必須である．一方，加齢に伴い多くの器官はその機能の低下がみられ，これら機能低下とその因子を明確とすることは，超高齢者社会を迎えるわが国において非常に重要である．加齢に伴う全身性機能の変化の一つとして，閉経およびそれに伴う骨量低下があげられる．この骨量低下は，男性と比較し，閉経後の高齢の女性で特に多くみられ，閉経後早期の骨減少は内分泌学的な宿主因子以外に危険因子が関係し骨減少を助長させる4）．これら閉経に伴う骨量低下の危険因子の一つとしてカルシウム不足が知られている．Cummingsはカルシウム摂取と骨量との関連について，閉経後早期の骨量はカルシウム摂取量が大きいほど高いと報告している5）．しかし，日常食品から十分なカルシウム量を摂取することはなかなかむずかしく，わが国において慢性的なカルシウム摂取不足が問題視されている．このように閉経後は，骨量低下を初めとした全身性の影響が現れることが知られている．本研究では，これら閉経後の骨量，カルシウム不足といった変化が角膜上皮の創傷治癒へ及ぼす影響について検討を行った．ラットのカルシウム欠乏による骨強度の低下実験では，卵巣摘出ラットへの低カルシウム飼料（0.01.0.3％の濃度6,7））摂取が行われ，開始週齢として3.16週齢8,9）と種々の病態が報告されている．一方，加齢ラットを用いカルシウムの欠乏状態を作製するためには長期間を要し，病態の程度も軽度である．そこで本研究では，短期間にカルシウム欠乏状態を作る目的で成長期の6週齢ラットへの低カルシウム飼料（0.006％）の摂取を行った．また，筆者らはこれまでの研究で，カルシウムの腸吸収にはイオン化したカルシウム（Ca2＋）含有濃度が重要であり，飼料中のカルシウム量増減よりも，飲料水によるCa2＋投与がカルシウム吸収において効果的であることを明らかとしている10）．本結果を基に，飲料水として精製水および市販ContrexRを用い，カルシウム摂取が非常に低い状態（PW群）と卵巣摘出により閉経状態に近い状態であるが，十分なカルシウム摂取を行った群（Contrex群）の2群について比較検討した．PWおよびContrex群いずれにおいても体重，飼料摂取量，飲水量に差はみられず，対象としたControl群と比較しその値は高まっていた．この結果から，食事摂取に関しては同程度の状態で飼育できたことがわかる（表1）．また，Contrex群の血中および骨中カルシウム量もControl群と同1626あたらしい眼科Vol.30，No.11，2013程度であり，コントレックスR飲水により，閉経後においても十分なカルシウム摂取が可能であった．一方，PW群ではControlおよびContrex群と比較し，血中および骨中カルシウム量が有意に低値を示した（表2）．したがってこの実験系を用いることにより，カルシウムの欠乏が十分にみられるPW群および一定のカルシウム供給が行われたContrex群間における，角膜上皮傷害治癒速度について比較検討が可能となった．角膜上皮は5.6層の細胞層から構成され，基底細胞と表層細胞に大きく分けられる．このうち基底細胞は分裂増殖機能と接着機能を，表層細胞はバリア機能および涙液保持機能を担っている．この4つの機能のどれか一つでも破綻した際角膜上皮傷害が認められる11）．角膜上皮の創傷治癒は，細胞の分裂・増殖，伸展・移動によって行われており，Thoft&Friendはこの角膜上皮の修復機構をXYZ理論（X：細胞分裂，Y：細胞移動，Z：細胞脱落）として，健常な角膜上皮では上記の3つの間にX＋Y＝Zの公式が成立することを提唱した11）．本研究で用いた角膜上皮.離モデルは，角膜上皮を.離することによって人工的にZを増大させた状態（X＋Y＜Z）である．筆者らを含むこれまでの研究で，角膜上皮傷害後の治癒過程として，.離18時間までは細胞接着を介した移動が優位に働き，傷害部を覆うことで，その傷害治癒が進み，.離18時間以降ではじめて細胞増殖が動くことが報告されている12.14）．今回の結果ではPW群で.離12，24時間における角膜傷害治癒率が，いずれもContrex群と比較し低値であったため（図1および表2），これら角膜上皮治癒遅延の主因として細胞接着の低下が関与するものと考えられた．Nagafuchiら15）はカルシウム濃度が細胞接着に関わり，このカルシウム低下は細胞接着能を低下させることを報告している．したがって，PW群でみられた血中カルシウム量の低下が，角膜の細胞接着能低下をひき起こし，これにより角膜上皮治癒遅延が起こったものと示唆された．今後，カルシウム欠乏と角膜傷害治癒速度の関係を明らかとするためには，さらなる研究が必要であり，現在筆者らは骨中，血中カルシウム濃度と角膜傷害治癒速度の相関性について明確にすべく，卵巣摘出および角膜上皮.離モデルを組み合わせ相関性の評価および低カルシウム状態下における角膜細胞接着，増殖能の検討を行っているところである．以上，本研究では卵巣摘出モデルを用いたinvivo実験において，低カルシウム食摂取時には角膜傷害治癒速度が低下することを明らかとした．これら全身の状態と角膜傷害治癒率の関係を把握することは，QOVおよびQOL向上を有する医療提供へ繋がるものと考えられる．文献1）厚生労働省：日本人の食事摂取基準2010年版．第一出版，（134） 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