《原著》あたらしい眼科33（10）：1497?1502，2016c抗菌点眼薬接触による細菌形態の塗抹標本上の変化李蘭若＊1,2佐々木香る＊1前田美佐穂＊3砂田淳子＊4小島隆司＊5村戸ドール＊5髙橋寛二＊2＊1JCHO星ヶ丘医療センター眼科＊2関西医科大学眼科学教室＊3JCHO星ヶ丘医療センター臨床検査部＊4大阪大学医学部附属病院臨床検査部＊5慶應義塾大学医学部眼科学教室ChangesinBacteriaonSmearPreparationafterAntibioticAdministrationRannyaRi1,2）,KaoruAraki-Sasaki1）,MisahoMaeda1）,AtsukoSunada3）,TakashiKojima4）,DogruMurat4）andKanjiTakahashi2）1）DepartmentofOphthalmology,JapanCommunityHealthCareOrganization（JCHO）HoshigaokaMedicalCenter,2）DepartmentofOphthalmology,KansaiMedicalUniversity,3）LaboratoryforClinicalInvestigation,JapanCommunityHealthCareOrganization（JCHO）HoshigaokaMedicalCenter,4）LaboratoryforClinicalInvestigation,OsakaUniversityHospital,5）DepartmentofOphthalmology,KeioUniversitySchoolofMedicine目的：塗抹鏡検は細菌性角膜炎の原因菌確定に重要な役割を果たしているが，実際の臨床現場，とくに抗菌薬投与下では，細菌や細胞の形状が非典型的となり，細菌か否かの鑑別が困難になることを経験する．今回，抗菌薬に接触した菌が塗抹鏡検上，どのような変化をきたすかを検討した．方法：眼科臨床分離株であるCNS,MRCNS,S.aureus,MRSA,P.aeruginosaの5菌種を用いた．各菌株を寒天培地上で培養し，トブラマイシン，ガチフロキサシン，アルベカシン，セフメノキシムの4点眼薬を滴下した．6時間，24時間，48時間後に培地中央から釣菌を行い，塗抹標本を作製し，菌の量，グラム染色による染色性，形状を観察した．対照として生理食塩水滴下群および非滴下群も観察した．結果：抗菌薬滴下により，すべての菌で菌量の減少，染色性の低下を認めた．さらに菌の輪郭の不明瞭化と大小不同を認めた．生理食塩水滴下群，非滴下群でも同様の所見を認めたが，抗菌薬滴下群ではより著明に変化を認めた．考按：塗抹鏡検は，抗菌薬投与の有無に大きく左右されることを考慮して解釈すべきである．Purpose：Itisgenerallyknownthatmicroscopicexaminationofsmearpreparationsplaysanimportantroleinidentifyingcausativeorganismsofmicrobialkeratitis.However,attimesitisdifficulttorecognizeanorganism,especiallyaftertheadministrationofantibiotics.Wehereobservedhoworganismschangeafterexposuretoantibiotics.Methods：Weemployed5speciesoforganisms（CNS,MRCNS,S.aureus,MRSA,P.aeruginosa）isolatedfromourpatientsfortheassay.EqualamountsoftheseorganismsweregrownonMueller-HintonSagarfor48hoursand4kindsofantibiotics（tobramycin,gatifloxacin,arbekacin,cefmenoxime）weredroppedontothecenterofeachplate.Physiologicalsalineservedascontrol.Bacteriawithoutexposuretoanyantibioticsandwithphysiologicalsalinewerealsoobserved.Results：Inalmostallorganisms,bacterianumbersdecreasedandstainabilityweakenedinatime-dependentmannerwithexposuretoantibiotics.Bacterialcellwallmarginsbecameblurredandorganismsizesshowedheterogeneity.P.aeruginosashowedextendedshapewithexposuretoCMX.Thoughdecreasednumbersandweakenedstainabilitywerenotedevenwithphysiologicalsaline,thesechangesweremoreremarkablewithantibiotics.Conclusion：Weshouldtakeextracareinanalyzingsmearsamplesaftertheirexposuretoantibiotics.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（10）：1497?1502,2016〕Keywords：細菌，抗菌点眼薬，塗抹検査，グラム染色．bacterium,antibioticeyedrop,smearexamination,gramstain.はじめに細菌性角膜炎の起因菌確定のために塗抹鏡検は重要である1?3）．とくに抗菌薬点眼がすでに投与されている症例では，培養を施行しても細菌の発育が認められず，塗抹鏡検で細菌が検出される場合があり，有用性が高いと推測されている．これまでの報告では，細菌性角膜炎の初診時検査において，塗抹鏡検での検出率は59％，培養での検出率も59％と報告されており4），実際には，塗抹鏡検においても，しばしば起因菌の検出は困難である．とくに，紹介受診の場合，抗菌薬点眼がすでに投与されている症例が多く，好中球を多数認めるが細菌が検出できない，細菌が存在しても菌数が少数である，形状が不均一である，などという結果を多く経験する．このような場合，検出された少量の細菌や非典型的な形状の細菌が，はたして起因菌であるかどうかの判断に苦慮する．そこで，今回は抗菌薬点眼接触後の細菌の量の変化および形態の変化を観察した．I方法眼科臨床分離株であるcoagulasenegativeStaphylococci（CNS），methicillinresistantcoagulasenegativeStaphylococci（MRCNS），Staphylococcusaureus（S.aureus），methicillinresistantStaphylococcusaureus（MRSA），Pseudomonasaeruginosa（P.aeruginosa）の5菌種を用いた．培地はMueller-HintonS寒天培地を用い，トブラマイシン点眼液（TOB），ガチフロキサシン点眼液0.3％（GFLX），自家調整0.5％アルベカシン点眼（ABK），セフメノキシム点眼液0.5％（CMX）の4種類の点眼薬を後述のように滴下した．対照として生理食塩水を使用し，非滴下群の菌も観察した．具体的には，まず各菌株をマックファーランド0.5に調整し，菌液10μlを採取し，100μlの生理食塩水に浮遊した後，Mueller-HintonS寒天培地全面に綿棒にて均一になるように塗布した．35℃で24時間培養し，その後，それぞれの培地の中央部に各種抗菌点眼薬を1滴ずつ1日2回，滴下した．滴下開始前，6時間後，24時間後，48時間後に，白金耳にて1回限りで培地中央をスタンプして付着した菌をスメアに供し，グラム染色を施行後，鏡検した．なお，光学顕微鏡（OlympusBx53,Tokyo,Japan）を用いて撮影した写真をimageanalyzer（ImageJ：NationalInstitutesofHealth,ver.1.41o）を用いて二画化し，1視野において菌の存在する面積を算出した．菌の残存率は接触前の1視野における菌の存在する面積を100％とし，24時間後，48時間後に残存した菌の存在する面積を解析し，残存した菌量を％として算出した．II結果代表例として，図1にMRCNSにGFLX点眼を滴下させた場合を示す．GFLX滴下後の菌は，0時間に比して6時間，24時間と減量および染色性の低下を認めた（図1a?c）．しかし，生理食塩水滴下群や非滴下群でも滴下前に比べ，菌の減量や染色性低下を認めた（図1d,e）が，GFLX点眼群ではより著明に変化を認めた．GFLX滴下群の24時間後の検体を強拡大にて観察すると，滴下前には均一にグラム陽性染色を示した菌が，紫色と赤色に染色されたものが混在して存在するようになり，時間経過とともにすべて赤色へと変化した．また，菌の輪郭そのものが次第に不明瞭となり，大小不同の形状を認めた（図2）．GFLX点眼を接触させたMRCNS以外の菌の結果を図3?1，3?2に示す．すべての菌で菌量の低下と染色性の低下が観察されたが，とくにCNSやP.aeruginosaでは，滴下6時間後から著明な菌の減少を認めた．生理食塩水を低下した群でも菌量の減少と染色性の低下は認められたが，GFLX滴下群ではより著明であった．なお，今回のアッセイでもっとも変化が大きかったのは，P.aeruginosaとCMXを接触させた場合の形状変化であった（図4）．滴下前には均一な桿菌の形状を示していたが（図4a），時間経過につれて，次第に細長く変化し，24時間後には糸状となった（図4b）．しかし，この変化は生理食塩水滴下群（図4c）や非滴下群（図4d）では観察されなかった．スメアで肉眼的に観察された抗菌薬使用による菌の残存率低下は，数値化を行っても確認された（図5）．すべての点眼投与群を平均した各種菌別の残存率は高い順に，MRSA（34.0％）＞MRCNS（31.0％）＞S.aureus（18.0％）＞P.aeruginosa（14.0％）＞CNS（5.7％）であった．全菌種，全抗菌薬を合わせて平均した24時間後の残存率は，抗菌薬滴下群では平均21％（0.9?57.8％）であったが，一方，生理食塩水でも，平均24％の残存率となった．しかし，48時間後では，抗菌薬滴下群の残存率は平均12％（0?31.6％）とさらに低下したが，生理食塩水滴下群では平均22.6％にとどまった．48時間後の各種点眼滴下群の菌残存率を図5に示す．CNSはすべての抗菌薬点眼滴下群で10％以下の残存率となり，P.aeruginosaではCMXを除く抗菌薬点眼群で1％以下となった．一方，S.aureusやMRCNS，MRSAなどの耐性菌では，CNSに比して残存率が高い傾向にあった．III考按今回のアッセイを通して，抗菌薬と接触した菌は少なくとも6時間後には菌量の減少，染色性の低下という塗抹鏡検上の変化をきたすことがわかった．抗菌薬を滴下作用させた場合において，6時間後には菌の減少，染色性低下を認め，24時間後では残存率が平均21％となり，48時間後ではさらに減少し平均12％の残存率となった．対照として滴下した生理食塩水でも菌量の軽度の減少，染色性の低下を認めたことから，滴下水流による洗い流しの影響があったと考えられる．しかし，生理食塩水滴下群では，24時間後と48時間後で残存率が大きく変化しなかったことから，抗菌薬滴下群では，滴下水流の影響に加え，抗菌薬それぞれの作用により塗抹鏡検上の変化をきたしたと考えられた．さらに観察期間を長くすると，生理食塩水と抗菌薬滴下群の差は大きくなると推測された．各種抗菌点眼薬を作用させた後の菌別の平均残存率をみると，CNS＞P.aeruginosa＞S.aureus＞MRCNS＞MRSAの順に菌が減少しやすいことがわかった．MRSAやMRCNSなどの耐性菌における菌の残存率が高く，CNSにおいては非常に低いという結果は，日常臨床の結果を反映している5,6）と考えるが，それぞれの菌の増殖性や抗菌薬の特性が異なり，含まれる防腐剤や添加材の影響，さらには，各々の点眼液の1滴当たりの量の違いもあり，一概に比較することには問題がある．染色性の低下は，グラム陽性菌では紫色から赤色へと色調の変化としてとらえられた．これは，抗菌薬の効果，滴下水流のストレス，栄養状態の悪化などにより細胞壁に多量に存在するペプチドグリカンの合成が妨げられ，クリスタルバイオレットの染色性が低下したためと考えられる7）．このためグラム陽性菌を陰性菌と誤って判断する可能性がある．グラム陽性菌では赤と紫が混合する時期があったことから，染色性の低下は一様に生じるものでなく，徐々に生じると推測された．この染色性の低下に伴い，薬剤感受性が変化するかどうかは今後の検討が必要であるといえる．なお，グラム陰性菌であるP.aeruginosaでも，CMX以外の抗菌薬を滴下した場合，陽性菌ほど色調の変化は認めないものの，ペプチドグリカンを細胞壁に含んでいるため，染色性が低下して薄いピンク色に変化し，また，細菌の輪郭も次第に不明瞭となり，菌であるかどうかの判別が困難であった．実際の臨床においても，抗菌薬が投与されている場合は，グラム陽性であれ，陰性であれ，染色性の低下を考慮して塗抹の結果を解釈すべきと思われた．今回，興味深いことにP.aeruginosaはCMX投与によって大きく変形することも示された．これは，臨床検査領域ではすでに報告されていることであるが8,9），眼科領域ではまだ一般的に十分周知されておらず，染色性は異なるものの放線菌や糸状真菌が病原菌となりうる疾患では鑑別に注意を要すると思われた．P.aeruginosaがCMXと接触して糸状に変化していく理由についてはすでに報告されている8,9）．細胞壁を合成する最終段階であるペプチド架橋反応にPBP（penicillinbindingprotein）という酵素が関与していることが知られている．そのなかでもPBP3は細胞壁の中隔形成に関与しており，CMXはPBP3に強力な結合親和性を有することから，細胞壁の中隔形成が阻害され細菌がフィラメント化すると推測されている．今回のアッセイでは明瞭に観察することができたが，実際の臨床でも，このような状態が存在している可能性があり，染色性は異なるものの，糸状菌や放線菌などとの鑑別に注意が必要であると思われた．P.aeruginosaにおけるCMX投与時の高い残存率は，このフィラメント化の影響により面積が大きくなったためであり，抗菌効果をそのまま反映しているとは考えにくいと思われた．なお，今回のアッセイはMueller-HintonS寒天培地で行われたが，これは通常，感受性試験に用いられる培地であり，栄養性に乏しい．また，各々の点眼でも1滴量はわずかに異なると思われる．実際の臨床環境を考慮した場合，菌の増殖性はさらに高く，好中球を始めとする各種免疫細胞の関与もあり，菌量や菌の形状，染色性に影響を及ぼすと考えられる．このように，机上の実験系と臨床での患者の眼表面とでは多くの条件が異なっているので，今回のアッセイをそのまま臨床に当てはめることには問題があるが，少なくとも抗菌薬との接触で菌の染色性の低下や菌量の減少が6時間には開始されることが明らかとなった．つまり，実際の臨床塗抹鏡検においては，検体採取はできるだけ抗菌薬投与前に実施するのが好ましいことが再確認されるとともに，すでに抗菌薬が投与された症例には塗抹検査結果の解釈に注意が必要であることがわかった．文献1）中川尚，秦野寛：眼科医のための塗抹検鏡アトラス．インフロント，20102）中川尚：スメアを採る．大橋裕一（編）：専門医のための眼科診療クオリファイ2結膜炎オールラウンド．中山書店，p25-30，20103）江口洋：Diagnostics角結膜感染症診断のポイント塗抹検鏡．眼科グラフィック3：357-362,20144）原田大輔，近間泰一郎，山田直之ほか：角膜感染症に対する直接塗抹顕微鏡検査の重要性の検討．臨眼63：231-235,20095）砂田淳子，上田安希子，井上幸次ほか：感染性角膜炎全国サーベイランス分離菌における薬剤感受性と市販点眼薬のpostantibioticeffectの比較．日眼会誌110：973-983,20066）井上幸次，大橋裕一，秦野寛ほか，眼感染症薬剤感受性スタディグループ：前眼部・外眼部感染症における起炎菌判定日本眼感染症学会による眼感染症起炎菌・薬剤感受性多施設調査．日眼会誌115：810-813,20117）中川尚：眼感染症─知っておくべきことから最新の治療まで塗抹検鏡．病原体同定．臨眼69：12-16,20158）横田健，関口玲子，東映子：Cefmenoxime（SCE-1365）の各種b-lactamaseおよびペニシリン結合タンパク質に対する親和性とその抗菌力との関係．CHEMOTHERAPY29（Supplement1）：32-41,19819）紺野昌俊，旭泰子，生方公子：大腸菌のペニシリン結合蛋白に対するb-ラクタム薬の親和性がMIC，殺菌効果ならびに形態変化におよぼす影響について．日本化学療法学会雑誌47：271-286,1999〔別刷請求先〕佐々木香る：〒573-8511枚方市星ヶ丘4-8-1JCHO星ヶ丘医療センター眼科Reprintrequests：KaoruAraki-SasakiM.D.,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,JCHOHoshigaokaMedicalCenter,4-8-1Hoshigaoka,Hirakata,Osaka573-8511,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY1498あたらしい眼科Vol.33，No.10，2016（112）図1MRCNSにGFLX点眼を接触させたコロニーのグラム染色による塗抹標本（弱拡大）a：滴下直後（0時間），b：滴下6時間後，c：滴下24時間後．時間の推移に伴い菌量の減少および染色性の低下を認めた．生理食塩水滴下後24h群（d）や非滴下群（e）でも染色性の低下や菌量の減少も認めたが，GFLX滴下群に比して軽度であった．bar：100μm．図2MRCNSにGFLX点眼を滴下した24時間後のグラム染色による塗抹標本（強拡大）滴下前（a）と比して，菌量の減少を認めるとともに，染色性も低下した．滴下開始前（a）には均一な紫色の染色性を示したが，6時間後（b）には，紫色と赤色が混在するようになり，24時間後（c）にはすべて赤色へと変化した．また，菌の輪郭そのものが次第に不明瞭となり，大小不同を認めた．bar：20μm．（113）あたらしい眼科Vol.33，No.10，20161499図3?1GFLX点眼および生理食塩水を接触させたCNS，S.aureusの0時間，6時間，24時間後のグラム染色による塗抹標本菌量の低下と染色性の低下が観察された．とくにCNSでは，滴下6時間後から著明な菌の減少を認めた．生理食塩水滴下群でも染色性の低下は認めるが，抗菌薬滴下で，より著明な菌量の減少を認めた．bar：100μm．図3?2GFLX点眼および生理食塩水を接触させたMRSA，P.aeruginosaの0時間，6時間，24時間後のグラム染色による塗抹標本菌量の低下と染色性の低下が観察された．とくにP.aeruginosaでは，滴下6時間後から著明な菌の減少を認めた．bar：100μm．あたらしい眼科Vol.33，No.10，2016（114）図4P.aeruginosaとCMXを接触させた場合の形状変化を示したグラム染色による塗抹標本滴下開始前（a）に比べ，24時間後（b）には，次第に細長く糸状に変化した．生理食塩水滴下群（c）や非滴下群（d）では，糸状変化は認めなられなかった．bar：100μm．図5各種点眼を滴下開始48時間後の菌残存率縦軸は菌残存率（％）を示す．生理食塩水滴下群においても菌の減少は認めるが，ほとんどの菌で抗菌薬点眼群において，さらに低い傾向を認めた．とくにCNSでは全抗菌薬滴下で低い残存率となった．S.aureusやMRCNS,MRSAではTOB,ABKが，他の抗菌薬点眼に比して低い残存率であった．P.aeruginosaはCMX以外の抗菌点眼薬で低い値となった．（115）あたらしい眼科Vol.33，No.10，201615011502あたらしい眼科Vol.33，No.10，2016（116）