あたらしい眼科

1374あたらしい眼科Vol.4109，21，No.3（00）1374（126）0910-1810/14/\100/頁/JCOPY《原著》あたらしい眼科31（9）：1374.1378，2014cはじめに長期にわたって点眼を余儀なくされる緑内障患者には，眼表面疾患を伴っている割合が高いことが報告されている1）．また，その重症度は点眼液の種類や点眼回数の増加により高まる傾向にあり1,2），これらの疾患には主薬の他にも点眼液中に含まれる防腐剤の種類や濃度が大きく関係していると考〔別刷請求先〕高嶋光代：〒103-8330東京都中央区日本橋本町2-2-2わかもと製薬株式会社Reprintrequests：MitsuyoTakashima,WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd.,2-2,Nihonbashi,Honcho2-Chome,Chuo-ku,Tokyo103-8330,JAPANカルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」のヒト角膜上皮細胞への影響と保存効力の検討高嶋光代＊1高橋佑次＊1中林夏子＊1山村雄＊1倉澤崇＊1伊藤雅起＊1内藤聡＊1富田剛司＊2＊1わかもと製薬株式会社＊2東邦大学医療センター大橋病院眼科InVitroEvaluationofGenericLong-ActingCarteololOphthalmicSolutionWAKAMOTORegardingHumanCornealDamagesandthePreservativeActivityMitsuyoTakashima1），YujiTakahashi1），NatsukoNakabayashi1），TakeruYamamura1），TakashiKurasawa1），MasakiIto1），AkiraNaito1）andGojiTomita2）1）WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd,2）DepartmentofOphthalmology,TohoUniversityOhashiMedicalCenter目的：カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」（以下，LA-W）の角膜上皮細胞に対する安全性と保存効力を評価した．方法：SV40不死化ヒト由来角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，HCE-Tに対するLA-Wおよびカルテオロール塩酸塩持続性点眼液（以下，MLA）の角膜上皮細胞に対する安全性を検討した．評価は50％細胞致死時間（CDT50），occludinの免疫染色および経上皮電気抵抗値（TER）を指標とした．LA-Wの保存効力については，指定菌株を用いて日本薬局方（第十六改正）を参考に実施した．結果：HCE-Tに対するCDT50は，LA-W処置群で1％および2％いずれも10.00分以上，MLA処置群では1％で2.62分，2％で4.14分を示した．Occludinの分布変化は，MLA処置群よりもLA-Wのほうが小さかった．また，TERはLA-WのほうがMLAよりも早期に回復した．さらに保存効力試験において，LA-Wはすべての菌株で日本薬局方の判定基準に適合した．結論：本評価系においてLA-Wはヒト角膜上皮細胞への影響が少なく，保存効力も十分に有していることが確認された．Purpose：Toevaluatethecornealepithelialcellcytotoxicityandpreservativeeffectofgenericlong-actingcarteololophthalmicsolution（LA-W）.Methods：SV40-immortalizedhumancornealepithelialcellline（HCE-T）wasusedforinves-tigatingcytotoxicity.AfterexposuretoLA-Worbland-namelong-actingcarteololophthalmicsolution（MLA）,50％cell-damagetime（CDT50）andtransepithelialelectricalresistance（TER）weremeasured.Inaddition,occludin,atightjunctionproteinwasimmunostainedafterexposuretothoseformulations.LA-Wwastestedforpreservativeeffectivenessinaccor-dancewiththeJapanesePharmacopoeia（JP16）.Result：CDT50forHCE-TwithLA-W1％and2％wasmorethan10min；withMLA1％and2％itwas2.62minand4.14min,respectively.TheTERofLA-WrecoveredearlierthandidthatofMLA.LA-WdidnotaffectoccludindistributioninHCE-T,whereasMLAaffectedaportionofit.Preservative-effectivenesstestresultsforLA-WconformedtoJPcriteria.Conclusion：LA-Wislessdamagingtoocularsurfacetissueandhassufficientpreservativeactivity.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（9）：1374.1378,2014〕Keywords：カルテオロール塩酸塩持続性点眼液，ベンザルコニウム塩化物（BAC），50％細胞致死時間，タイトジャンクション，保存効力．long-actingcarteololophthalmicsolution,benzalkoniumchloride,CDT50,tightjunction,preservative-effectiveness.（00）1374（126）0910-1810/14/\100/頁/JCOPY《原著》あたらしい眼科31（9）：1374.1378，2014cはじめに長期にわたって点眼を余儀なくされる緑内障患者には，眼表面疾患を伴っている割合が高いことが報告されている1）．また，その重症度は点眼液の種類や点眼回数の増加により高まる傾向にあり1,2），これらの疾患には主薬の他にも点眼液中に含まれる防腐剤の種類や濃度が大きく関係していると考〔別刷請求先〕高嶋光代：〒103-8330東京都中央区日本橋本町2-2-2わかもと製薬株式会社Reprintrequests：MitsuyoTakashima,WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd.,2-2,Nihonbashi,Honcho2-Chome,Chuo-ku,Tokyo103-8330,JAPANカルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」のヒト角膜上皮細胞への影響と保存効力の検討高嶋光代＊1高橋佑次＊1中林夏子＊1山村雄＊1倉澤崇＊1伊藤雅起＊1内藤聡＊1富田剛司＊2＊1わかもと製薬株式会社＊2東邦大学医療センター大橋病院眼科InVitroEvaluationofGenericLong-ActingCarteololOphthalmicSolutionWAKAMOTORegardingHumanCornealDamagesandthePreservativeActivityMitsuyoTakashima1），YujiTakahashi1），NatsukoNakabayashi1），TakeruYamamura1），TakashiKurasawa1），MasakiIto1），AkiraNaito1）andGojiTomita2）1）WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd,2）DepartmentofOphthalmology,TohoUniversityOhashiMedicalCenter目的：カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」（以下，LA-W）の角膜上皮細胞に対する安全性と保存効力を評価した．方法：SV40不死化ヒト由来角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，HCE-Tに対するLA-Wおよびカルテオロール塩酸塩持続性点眼液（以下，MLA）の角膜上皮細胞に対する安全性を検討した．評価は50％細胞致死時間（CDT50），occludinの免疫染色および経上皮電気抵抗値（TER）を指標とした．LA-Wの保存効力については，指定菌株を用いて日本薬局方（第十六改正）を参考に実施した．結果：HCE-Tに対するCDT50は，LA-W処置群で1％および2％いずれも10.00分以上，MLA処置群では1％で2.62分，2％で4.14分を示した．Occludinの分布変化は，MLA処置群よりもLA-Wのほうが小さかった．また，TERはLA-WのほうがMLAよりも早期に回復した．さらに保存効力試験において，LA-Wはすべての菌株で日本薬局方の判定基準に適合した．結論：本評価系においてLA-Wはヒト角膜上皮細胞への影響が少なく，保存効力も十分に有していることが確認された．Purpose：Toevaluatethecornealepithelialcellcytotoxicityandpreservativeeffectofgenericlong-actingcarteololophthalmicsolution（LA-W）.Methods：SV40-immortalizedhumancornealepithelialcellline（HCE-T）wasusedforinves-tigatingcytotoxicity.AfterexposuretoLA-Worbland-namelong-actingcarteololophthalmicsolution（MLA）,50％cell-damagetime（CDT50）andtransepithelialelectricalresistance（TER）weremeasured.Inaddition,occludin,atightjunctionproteinwasimmunostainedafterexposuretothoseformulations.LA-Wwastestedforpreservativeeffectivenessinaccor-dancewiththeJapanesePharmacopoeia（JP16）.Result：CDT50forHCE-TwithLA-W1％and2％wasmorethan10min；withMLA1％and2％itwas2.62minand4.14min,respectively.TheTERofLA-WrecoveredearlierthandidthatofMLA.LA-WdidnotaffectoccludindistributioninHCE-T,whereasMLAaffectedaportionofit.Preservative-effectivenesstestresultsforLA-WconformedtoJPcriteria.Conclusion：LA-Wislessdamagingtoocularsurfacetissueandhassufficientpreservativeactivity.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（9）：1374.1378,2014〕Keywords：カルテオロール塩酸塩持続性点眼液，ベンザルコニウム塩化物（BAC），50％細胞致死時間，タイトジャンクション，保存効力．long-actingcarteololophthalmicsolution,benzalkoniumchloride,CDT50,tightjunction,preservative-effectiveness.察されている3）．ベンザルコニウム塩化物（以下，BAC）は高い保存効力を有し，水溶性で化学的にも安定なことから，マルチドーズ型点眼薬に頻用されている防腐剤である4）．その一方で，BACは角結膜上皮障害などの副作用を引き起こすことが多々報告されており3.5），点眼液中BAC濃度の設定には点眼液の保存効力に加えて眼表面への安全性も考慮する必要がある．カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」（わかもと製薬㈱，以下，LA-W）は，カルテオロール塩酸塩を1％または2％含有する持続型緑内障・高眼圧症治療用点眼液であり，ミケランRLA点眼液（大塚製薬㈱，以下，MLA）の後発品として開発された．両者はともに防腐剤としてBACを含有しているが，LA-WはBAC濃度を0.001％まで抑え眼表面への影響を考慮しているのが特徴である．本研究においては，LA-Wの眼表面に対する安全性についてヒト角膜上皮細胞を用いて検討し，加えて，LA-Wの保存効力を日本薬局方の保存効力試験を参考に評価した．I材料および方法1.試験物質および試薬LA-W1％および2％，MLA1％および2％を使用した．ヒト角膜上皮細胞を用いた安全性評価試験には，陰性対照としてphosphatebufferedsaline（PBS）（Gibco,Lifetechnolo-gies），陽性対照としてベンザルコニウム塩化物（BAC，東京化成工業㈱）のPBS溶解液（BAC0.001％/0.002％/0.005％/0.02％）を適宜用いた．2.ヒト由来角膜上皮細胞による安全性評価SV40不死化ヒト由来角膜上皮細胞（以下HCE-T，RCBNo.2280：理化学研究所）は，Supplementedhormonalepithelialmedium（SHEM）改変培養培地〔5％ウシ胎児血清（FBS），10ng/mLEGF，5μg/mLインスリン，0.5％DMSOを含むDMEM/F-12〕にて37°C，5％CO2下で培養した．a.細胞障害性試験HCE-Tは96wellプレートに2×104cells/wellとなるように播種し，CO2インキュベーター内で24時間培養した．つぎに，培養培地からLA-WおよびMLAの1％または2％，PBS，BAC溶液（0.001,0.005％）50μLへそれぞれ置換し，1，2，5または10分間接触させた．その後，PBSによる洗浄を経て培養培地100μLに置換し，CO2インキュベーター内で再び24時間培養した．各wellにCellCountingKit-8（同仁化学研究所）を10μLずつ添加しCO2インキュベーター内で2時間培養後，マイクロプレートリーダー（InfiniteM200FLABS，テカンジャパン㈱）により吸光度（450/630nm）を測定した．PBS処置群の吸光度を100として，細胞生存率（％）を算出した後，各種点眼薬の50％細胞致死時間（以下，CDT50）を算出した．（127）b.Occludinの免疫染色HCE-Tは24wellプレートに5×104cells/wellとなるように播種し，CO2インキュベーター内で3日間培養した．次に培養培地をLA-WおよびMLAの2％，PBSおよびBAC溶液（0.002％）300μLに置換し，10分間接触させた．その後，PBSにより試験物質を洗浄除去し，.20°Cに冷却した100％メタノールで約15分間固定した．1％BSA/PBSを1時間室温処置でブロッキング後，1次抗体の抗occludin抗体（1：100，Invitrogen）を，続いて2次抗体としてAlexaFlour-488-conjugatedanti-mouseIgG（1：1000，Invitrogen）を室温で順に1時間ずつ反応させた．VECTASHIELDMountingMediumwithDAPIを滴下，封入して評価標本とし，蛍光顕微鏡（IX70，オリンパス㈱））により観察した．c.経上皮電気抵抗値による評価経上皮電気抵抗値（以下，TER）の測定にはMillicellERS-2抵抗値測定システム（メルク㈱）を用いた．HCE-Tは24wellトランズウェルプレートのトップ・チャンバーに5×104cells/wellとなるように播種し，CO2インキュベーター内で5日間培養した．トップ・チャンバーの培養培地をLA-WおよびMLAの2％およびBAC溶液（0.001,0.005,0.02％）100μLでそれぞれ置換し，1分間接触させた後に培養培地により試験物質を洗浄除去，培養培地200μLで置換した．培養培地置換直後を0分として試験物質接触前（Pre），0，30，60，90，120分後のTERをそれぞれ測定し，Pre値に対するTERの変化率（％）を算出した．3.保存効力試験日本薬局方（第十六改正）の保存効力試験法を参考に，LA-Wの保存効力試験を塗抹法にて実施し，点眼液に適応されるカテゴリーIAの基準に従って評価した．細菌として，Staphylococcusaureus（菌株：ATCC6538），Pseudomonasaeruginosa（菌株：ATCC9027），Escherichiacoli（菌株：ATCC8739），真菌として，Candidaalbicans（菌株：ATCC10231）およびAspergillusbrasiliensis（菌株：ATCC16404）を使用した．4.統計解析統計解析はSPSSStatisticsを用い，各点眼液処置後のTER変化率の推移について2元配置分散分析を実施した．なお，有意水準は5％とした．II結果1.角膜上皮細胞に対する安全性a.HCE.Tへの障害性BAC0.001％および0.005％のCDT50はそれぞれ4.00分および1.00分未満であり，濃度依存的な細胞障害性があることを確認した（図1，表1）．LA-W処置群は1％，2％ともに，接触時間10分においても60％以上の細胞生存率を維あたらしい眼科Vol.31，No.9，201413751376あたらしい眼科Vol.31，No.9，2014（128）持し，CDT50は10.00分以上であった．一方，MLA処置群のCDT50は，1％，2％でそれぞれ2.62分，4.14分であった．b.Occludinの局在分布への影響LA-W処置群におけるoccludinの分布は，陰性対照であるPBS処置群と同様に細胞接着面で連続した線状をおおむね維持しており，局在特性に大きな変化は観察されなかった（図2C）．一方，BAC0.002％およびMLA処置群は，PBSおよびLA-W処置群と比べてoccludinの分布が破線状に変化している部分が多く観察された（図2B，D）．c.TERによる評価全群で処置に由来すると考えられる一過性のTERの低下が認められた．カルテオロール濃度2％の点眼液同士で比較した場合，LA-W処置群はMLA処置群よりもTERが早期に回復した（図3A，p＝0.015）．また，BACは濃度依存的にTERを減少させ，TERの回復はBAC0.001％処置群では認められたものの，BAC0.005％以上の処置群では認めら表1CDT50一覧群名CDT50LA-W1％＞10.00分LA-W2％＞10.00分MLA1％2.62分MLA2％4.14分BAC0.001％4.00分BAC0.005％＜1.00分020406080100024681012細胞生存率（％）薬剤接触時間（分）図1薬剤接触後のHCE.Tの細胞生存率（％）値は平均値を示す（n＝6）．○：LA-W1％，●：LA-W2％，◇：MLA1％，◆：MLA2％，△：BAC0.001％，▲：BAC0.005％．ADCB図2薬剤接触後のHCE.Tのoccludin分布（緑：occludin，青：核）A：PBS，B：BAC0.002％，C：LA-W，D：MLA．一部の薬剤により，occludinの局在が大きく阻害された（矢印）．Bar＝20μm.（128）持し，CDT50は10.00分以上であった．一方，MLA処置群のCDT50は，1％，2％でそれぞれ2.62分，4.14分であった．b.Occludinの局在分布への影響LA-W処置群におけるoccludinの分布は，陰性対照であるPBS処置群と同様に細胞接着面で連続した線状をおおむね維持しており，局在特性に大きな変化は観察されなかった（図2C）．一方，BAC0.002％およびMLA処置群は，PBSおよびLA-W処置群と比べてoccludinの分布が破線状に変化している部分が多く観察された（図2B，D）．c.TERによる評価全群で処置に由来すると考えられる一過性のTERの低下が認められた．カルテオロール濃度2％の点眼液同士で比較した場合，LA-W処置群はMLA処置群よりもTERが早期に回復した（図3A，p＝0.015）．また，BACは濃度依存的にTERを減少させ，TERの回復はBAC0.001％処置群では認められたものの，BAC0.005％以上の処置群では認めら表1CDT50一覧群名CDT50LA-W1％＞10.00分LA-W2％＞10.00分MLA1％2.62分MLA2％4.14分BAC0.001％4.00分BAC0.005％＜1.00分020406080100024681012細胞生存率（％）薬剤接触時間（分）図1薬剤接触後のHCE.Tの細胞生存率（％）値は平均値を示す（n＝6）．○：LA-W1％，●：LA-W2％，◇：MLA1％，◆：MLA2％，△：BAC0.001％，▲：BAC0.005％．ADCB図2薬剤接触後のHCE.Tのoccludin分布（緑：occludin，青：核）A：PBS，B：BAC0.002％，C：LA-W，D：MLA．一部の薬剤により，occludinの局在が大きく阻害された（矢印）．Bar＝20μm.APre値表2保存効力試験の結果：各菌株の菌数（Log10CFU/mL）Pre値表2保存効力試験の結果：各菌株の菌数（Log10CFU/mL）A：LA-W1％TER相対変化率（％）－20＊p＝0.015菌株※1－40Sa－60PaEcCa－80－100Ab洗浄後時間（分）接種菌数5.85.65.85.65.0B：LA-W2％保存期間（日）保存期間（日）接種14NDNDNDNDND菌株※1菌数281428NDSa5.8NDNDNDPa5.6NDNDNDEc5.8NDNDNDCa5.6NDNDNDAb5.0NDND0306090120ND：0.8Log10CFU/mL未満（接種菌数の0.001％未満）．BPre値※1菌株Sa：Staphylococcusaureus，Pa：Pseudomonasaeruginosa，Ec：Escherichiacoli，Ca：Candidaalbicans，Ab：0Aspergillusbrasiliensis－20加されているため，単に添加濃度を下げれば良いというもの－40ではない．マルチドーズ型点眼液中の防腐剤濃度を設定する－60に当たっては，角膜表面に対する安全性と保存効力のバランスを考慮することが重要となる．LA-Wは，添加剤を工夫することによって低粘度ながらもMLAと同等の眼圧下降作－80TER相対変化率（％）0306090120洗浄後時間（分）図3薬剤接触後のHCE.TにおけるTER変化率の推移（％）値は平均値±標準誤差を示す（n＝4）．A：LA-WおよびMLA，B：BAC．●：LA-W2％，◆：MLA2％，△：BAC0.001％，▲：BAC0.005％，▲：BAC0.02％，＊p：vsMLA［2元配置分散分析］．れなかった（図3B）．2.保存効力試験LA-Wにおける生菌数（Log10CFU/mL）の推移を表2に示す．開始時の生菌数は，5.0.5.8Log10CFU/mLであった．菌接種後14および28日の生菌数は，LA-W1％，2％ともにすべての菌株で検出限界以下（0.8Log10CFU/mL未満）となり，LA-Wは日本薬局方の判定基準に適合した．III考按国内で上市されている点眼液中の防腐剤としてのBAC添加濃度は0.005.0.01％である場合が多く，国内使用実績としては0.02％が最大濃度である4）．BACによる角膜障害は濃度依存的に引き起こされることが報告されており4.6），近年では各点眼液中防腐剤の種類および濃度，角膜上皮障害との関係も種々検討され始めている4,6,7）．このような背景には，点眼液の眼表面に対する安全性への配慮がこれまで以上に求められていることが考えられる．しかしながら，点眼液中の防腐剤は本来，使用に伴う二次的な汚染防止を目的として添（129）用をもち，さらにBACを最小限（0.001％）まで抑えた処方を採用している．本研究ではLA-Wの角膜上皮細胞に対する安全性および保存効力を評価することを目的として種々の検討を行った．角膜上皮細胞は点眼時に点眼液が最初に接触する組織の一つであり，同時に外因性物質の侵入を防ぐバリア機能を担っている．これまでに，BACとの接触によりoccludinの消失がみられるとの報告や8），タイトジャンクションの構成蛋白であるoccludinやZO-1の発現減少に伴ってTERが低下するとの報告9.11）があることから，点眼液由来のBACが角膜上皮のタイトジャンクションに対して影響を及ぼすことが考えられる．そこで，安全性評価にはヒト由来角膜上皮細胞を用いて，細胞障害性試験およびバリア機能の一端を担うタイトジャンクションの形態およびその機能を検討した．細胞障害性試験において，LA-W1％，2％ともにMLAよりも高い細胞生存率を推移した（1％；LA-W：10.00分以上，MLA：2.62分，2％；LA-W：10.00分以上，MLA：4.14分）．また，LA-WおよびMLA，どちらの点眼液においてもカルテオロール濃度2％処置群のほうが1％処置群よりも高い細胞生存率で推移したことから，主薬であるカルテオロールには細胞保護効果があることが示唆された．BAC0.001％処置群よりもそれと同量のBACを含むLA-W処置群で細胞生存率が高かったのは，カルテオロール自身による細胞保護効果に起因した可能性が考えられた．Occludinの局在変化はLA-W処置群のほうがMLA処置群よりも小さく，さらにTER変化率の推移においても，LA-W処置群はMLA処置群よりも速やかな回復性を示した．以上より，あたらしい眼科Vol.31，No.9，20141377LA-Wは細胞障害性および角膜上皮細胞のタイトジャンクションに対する影響は小さく，安全性が高いことが示された．各点眼液に添加されている特記すべき添加物は，LA-Wはホウ酸，マンニトールおよびBAC，MLAはアルギン酸およびBACである．これらのなかから角膜上皮細胞の安全性に影響する添加物について考察した．角膜上皮細胞に対してマイナス要因となりうる添加物は，LA-Wに含まれるホウ酸12），両点眼液に含まれるBACである．LA-Wに含まれるホウ酸の安全性を調べるため，BACを含有しないLA-Wの基剤について細胞障害性試験を実施したところ，細胞生存率はPBS群と同様の推移を示した（データ非掲載）．ゆえに，LA-W中に含有するホウ酸の角膜上皮細胞に対する影響は非常に低いことが示唆された．一方BACは，細胞障害性と添加濃度が大きく関係していることが知られている3,4）．各点眼液のBAC添加濃度は，MLAが0.005％13），対してLA-Wは0.001％であり，LA-WはMLAと比べてBAC濃度が5分の1に抑えられている．以上より，LA-Wの角膜上皮への高い安全性には点眼液中BAC含量の減量に由来していることが推察された．プラス要因としてはLA-Wに含まれるマンニトールが考えられる．長井らは，点眼液中のマンニトールがBAC自身の毒性を軽減している可能性を示唆しており14），LA-Wに含まれるマンニトールもLA-Wの角膜上皮の安全性に寄与しうると考えられた．保存効力試験では，LA-WはBAC濃度が低く抑えられているにもかかわらず日本薬局方の判定基準を満たす保存効力を示した．その要因としてLA-Wにホウ酸が添加されていることが挙げられる．筆者らは，過去にカルテオロールを含むb遮断薬とホウ酸を組み合わせた処方が保存効力を有することを見出し，特許を取得している15）．LA-Wはこの条件を満たした処方となっているため，BAC濃度を抑えても保存効力を維持することが可能となったと推察している．本研究からLA-Wはヒト角膜上皮細胞への影響が少なく，保存効力も十分に有していることを確認した．患者の良好なアドヒアランスを保つためには，服薬を妨げる因子をできるだけ排除することも大切であると考えられる．ゆえに，角膜上皮に対して影響が少なく保存効力も十分に有する点眼液は，患者の長期服薬をサポートすることにも繋がると考えている．今後は，患者の眼表面に対する安全性と点眼液の保存効力，この双方に対して十分配慮した製剤設計が緑内障治療薬に対してもますます求められていくと考える．文献1）LeungEW,MedeirosFA,WeinrebRN：Prevalenceofocularsurfacediseaseinglaucomapatients.JGlaucoma17：350-355,20082）FukuchiT,WakaiK,SudaKetal：Incidence,severityandfactorsrelatedtodrug-inducedkeratoepitheliopathywithglaucomamedications.ClinOphthalmol4：203-209,20103）川瀬和秀：シンポジウムII：緑内障に関する最近のトピックス緑内障点眼薬の毒性．眼薬理27：56-60,20134）浅田博之，七篠（高岡）優子，中村雅胤ほか：0.0015％タフルプロスト点眼液のベンザルコニウム塩化物濃度の最適化検討─眼表面安全性と保存効力の視点から─．薬学雑誌130：867-871,20105）BursteinNL：Preservativecytotoxicthresholdforbenzalkoniumchlorideandchlorhexidinedigluconateincatandrabbitcorneas.InvestOphthalmolVisSci19：308-313,19806）福田正道，稲垣伸亮，萩原健太ほか：ラタノプロスト後発品点眼薬の角膜上皮細胞に対する安全性の検討．あたらしい眼科28：849-854,20117）NakagawaS,UsuiT,YokooSetal：Toxicityevaluationofantiglaucomadrugsusingstratifieldhumancultivatedcornealepithelialsheets.InvestOphthalmolVisSci53：5154-5160,20128）PaulyA,MeloniM,Brignole-BaudouinFetal：Multipleendpointanalysisofthe3D-reconstitutedcornealepitheliumaftertreatmentwithbenzalkoniumchloride：Earlydetectionoftoxicdamage.InvestOphthalmolVisSci50：1644-1652,20099）BamforthS.D,KnieselU,WolburgHetal：Adominantmutantofoccludindisruptstightjunctionstructureandfunction.JCellSci112：1879-1888,199910）YiX,WangY,YuFS：Cornealepithelialtightjunctionsandtheirresponsetolipopolysaccharidechallenge.InvestOphthalmolVisSci41：4093-4100,200011）KimuraK,TeranishiS,NishidaT：Interleukin-1b-induceddisruptionofbarrierfunctioninculturedhumancornealepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci50：597603,200912）ImayasuM,ShiraishiA,OhashiYetal：Effectsofmultipurposesolutionsoncornealepithelialtightjunctions.EyeContactLens34：50-55,200813）望月英毅，木内良明：b遮断薬．あたらしい眼科29：451455,201214）長井紀章，村尾卓俊，大江恭平ほか：不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた緑内障治療配合剤のinvitro角膜細胞傷害性評価．薬学雑誌131：985-991,201115）中谷清吾，大山祐賀子，鈴木秀一：点眼用水性組成物．特許国際公開番号：WO2011013794A1＊＊＊（130）