あたらしい眼科

《第33回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科31（5）：729.732，2014cウサギ赤血球を用いたベンザルコニウム塩化物の傷害性評価とセリシンによる保護効果長井紀章＊1藤田裕美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室PreventiveEffectofSericinonBenzalkoniumChlorideStimulationofRabbitRedBloodCellsNoriakiNagai1）,HiromiFujita1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）andYoshikazuShimomura2）1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine筆者らはこれまで，点眼用保存剤ベンザルコニウム塩化物（BAC）とセリシンを併用することで，長期連続使用可能で安全な点眼用保存剤になりうることを報告してきた．本研究では，ウサギ赤血球を用いた細胞傷害評価モデルにより，セリシンでBAC細胞傷害軽減効果について検討を行った．BAC単独処理群では，10μg/mlBAC処理で溶血率は90.1％となったが，セリシン添加によりBACの溶血作用は軽減され，10μg/mlBAC溶液に0.5％セリシンを併用処理した際の溶血率は17.5％であった．また，セリシンによるBAC細胞傷害軽減作用は濃度依存的に増加した．これら結果とは異なり，セリシンで30分間前処理したものでは，BAC刺激に伴う溶血に対し保護効果を示さなかった．以上，セリシン併用処理によるBACの細胞傷害抑制機構の一つに，刺激に対する細胞膜保護が起因することを明らかとした．Wepreviouslyreportedthattheadditionofsericindecreasesthecornealdamagecausedbybenzalkoniumchloride（BAC）,andthatapreservativesystemcomprisingBACandsericinprovideseffectivetherapyforpatientsrequiringlong-termeyedroptreatment.Inthepresentstudy,weinvestigatedthepreventiveeffectofsericinonBACstimulationofrabbitredbloodcells.Thehemolysisrateinredbloodcellswas90.1％after10μg/mlBACstimulationfor1h.Weadded0.5％sericintoaffecttherateofhemolysisbyBACstimulation；thehemolysisrateundercombinationtreatmentwith10μg/mlBACand0.5％sericinwas17.5％.Inaddition,thepreventiveeffectofsericinincreasedwithsericinconcentration.Ontheotherhand,thepreventiveeffectagainstBACstimulationwasnotobservedwithsericinpretreatmentfor30min.Theseresultsshowthattheadditionofsericinenhancescellmembranetolerance.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（5）：729.732,2014〕Keywords：セリシン，ベンザルコニウム塩化物，ウサギ赤血球，細胞傷害，保存剤．sericin,benzalkoniumchloride,rabbitredbloodcells,cellstimulation,preservative.はじめに眼科領域における薬物療法の中心は点眼薬である．点眼薬の多くは，全身投与薬としてすでに開発されている薬物を点眼薬として製剤化することで開発されてきた．しかし点眼薬の主成分となる薬物（主剤）のみでは点眼薬は製剤として成り立たず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる1）．したがって製剤学的観点から点眼薬について考える際には，その点眼薬に含まれる添加剤の種類，添加目的（効果），傷害性（副作用）についても常に考慮しなければならない．一般的に点眼薬には保存剤〔ベンザルコニウム塩化物（BAC）など〕，等張化剤（塩化ナトリウム，ホウ酸，グリセリンなど），緩衝剤（リン酸緩衝液，ホウ酸など），また必要であれば，界面活性剤（ポリソルベート80など），安定化剤〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（103）729〔エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など〕，粘稠化剤〔ポリビニルアルコール（PVA），ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロースなど〕などが含まれる1）．これら添加剤のなかでも保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．特に，BACは眼科領域において代表的な保存剤であり，パラベン類やクロロブタノールなどの他の保存剤と比較し保存効力が高く，水溶性で化学的にも安定であり，扱いやすいことから点眼薬領域の約7割で使用されている2）．しかしながら，BACは細胞傷害性を有し，長期使用により薬剤性角膜上皮傷害がみられることから，近年臨床において問題視されている．このような背景から，点眼回数を減らすなどBAC曝露量を減らすといった試みがなされているが，長期にわたり多剤併用を必要とする眼疾患治療（緑内障など）においては，これらの対策はむずかしいのが現状である3,4）．また，近年ではBACを含有しないポリクォッド（塩化ポリドロニウム）およびSofZia（塩化亜鉛，ホウ酸を含むソルビトール緩衝剤保存システム）をそれぞれ保存剤として用いたデュオトラバRやトラバタンズRのような製剤が開発・市販されているが5），上記保存システムはBACと比較し保存効力が低いため，欧米など日本以外の国々では使用が認可されていないのが現状である．一方，微生物の侵入を防ぐ特殊な容器を使用した保存剤非含有製剤も市販されているが，使用法およびコスト面で問題があるため，BACを基盤とした目に優しい点眼用保存システムの開発が切望されている．筆者らはこれまで，カイコ繭由来の絹タンパク質であるセリシンに注目し，セリシンとBAC併用による点眼用保存システム（BAC/セリシン保存システム）が，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発へ有用であることを報告してきた6）．今回，このBAC/セリシン保存システムの細胞傷害保護機構を明確にすべく，ウサギ赤血球モデルを用い，セリシンのBAC細胞傷害保護効果について検討を行った．I対象および方法1.実験動物実験には2.5.3.0kg日本白色種雌性ウサギを用いた．これらウサギは25℃に保たれた環境下で飼育し，飼料（飼育繁殖固形飼料CR-3，日本クレア）および水は自由に摂取させた．動物実験は，近畿大学実験動物規定に従い行った．2.試薬セリシン（30kDa）はセーレン（株）から供与されたものを用いた．BACおよびヘパリンナトリウムは和光純薬，リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco’sPhosphateBufferedSaline：PBS）はGIBCOから購入したものを用いた．3.ウサギ赤血球標品の調製ウサギ耳静脈より採血した血液1mlと100μlヘパリン730あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014（10mg/ml）を混和後，遠心分離（3,000rpm，37oC，5min）を行った．その後上清を捨て，沈殿とPBSが1：3となるようにPBSを加え，さらに遠心分離（2,000rpm，37oC，5min）を行い，沈殿の回収を行った．これら洗浄操作を2回繰り返したものを赤血球標品として本実験に用いた．陽性対照とした完全溶血赤血球は，精製水2mlに赤血球標品40μlを添加することで作製した．4.浸透圧刺激に伴う溶血率変化の測定上記方法中「3．ウサギ赤血球標品の調製」にて示した赤血球標品40μlを0.1.0.5％セリシン含有または非含有の食塩水（125.215mOsm）2ml中に加え，37oCにて1時間インキュベートを行った．その後，遠心分離（2,300rpm，37oC，5min）にて上清を採取し，576nmにおける吸光度の測定をすることで浸透圧刺激に伴う溶血率変化を示した．また，セリシン前処理時には，赤血球標品を0.1.0.5％セリシン含有または非含有の生理食塩水にて30分間インキュベート後，生理食塩水にて洗浄を行い，上記に示した125.215mOsm食塩水により浸透圧刺激を行った．本研究では，処理後の溶血率（％）を次式（1）により算出した．溶血率（％）＝（試験液吸光度.空試験吸光度）/（陽性対照吸光度.空試験吸光度）×100（1）5.BAC処理に伴う溶血率変化の測定上記方法中「3．ウサギ赤血球標品の調製」にて示した赤血球標品40μlを0.1.0.5％セリシンおよびBAC含有または非含有の生理食塩水（BAC濃度，8.12μg/ml）2ml中に加え，37oCにて1時間インキュベートを行った．その後，遠心分離（2,300rpm，37oC，5min）にて上清を採取し，576nmにおける吸光度の測定をすることでBAC刺激に伴う溶血率変化を示した．また，セリシン前処理時には，赤血球標品を0.1.0.5％セリシン含有または非含有の生理食塩水にて30分間インキュベート後，生理食塩水にて洗浄を行い，上記に示した8.12μg/mlBACにより刺激を行った実験に用いた．処理後の溶血率（％）算出には上記式（1）を用いた．6.統計学的処理実験結果は平均値±標準誤差（SE）で表した．有意差検定はJAMVer.5.1（日本SAS協会）コンピュータプログラムを用いて行った．各々の実験値はDunnettの多群間比較により解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.セリシンによるBAC細胞傷害保護効果図1は浸透圧変化に伴う溶血性変化とセリシンの保護効果を示す．等張時，赤血球の溶血はみられなかったが，浸透圧を下げていくことで溶血が認められた．これら溶血は200mOsm以下でみられ，140mOsmではほぼ完全に溶血した（104）100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）Osmoticpressure（mOsm）A：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）B：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）Osmoticpressure（mOsm）A：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）B：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Osmoticpressure（mOsm）図1セリシン前処理（A）または併用処理（B）が浸透圧変化による赤血球の溶血へ与える影響平均値±標準誤差，n＝5.6，＊p＜0.05,vs.Saline．（図1A）．一方，セリシンを併用処理することで，これら赤血球溶血の保護効果がみられ，155mOsmの条件下0.5％セリシン併用処理群の溶血率は16.3％であり，非処理群と比較し有意に低値を示した（図1B）．図2はBAC刺激に伴う溶血性変化とセリシンの保護効果を示す．BAC刺激により溶血が認められ，8μg/mlBAC刺激による溶血率は23.3％，10μg/mlBAC刺激では90.1％であった．セリシン併用処理はBAC刺激に対しても細胞傷害保護効果を示し，8μg/mlBAC刺激時では溶血はほとんど認められず，10μg/mlBAC刺激時における非処理群のそれの17.5％であった．また，浸透圧変化およびBAC刺激時におけるセリシンの保護効果は濃度依存的であった．これらセリシン併用処理実験の結果とは異なり，セリシンを30分間前処理したものでは，浸透圧およびBAC刺激に伴う溶血に対し保護効果を示さず，今回用いたいずれの濃度においても，溶血挙動に差はみられなかった（図1Aおよび図2A）．III考按セリシンは，絹糸原糸タンパク質の約20％を占める主要成分である．従来，セリシンは絹糸精製（精練）段階で廃棄されてきた物質であったが，保湿性や抗酸化能をもつことが明らかとなり，近年では産業資材や化粧品などに利用されて（105）100806040200Hemolyticratio（%）A：Saline■：0.1%sericin■：0.25%sericin■：0.5%sericin89101112BACconcentration（mg/ml）10080604020089101112Hemolyticratio（%）B：Saline■：0.1%sericin■：0.25%sericin■：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊BACconcentration（mg/ml）図2セリシン前処理（A）または併用処理（B）がBAC刺激による赤血球の溶血へ与える影響平均値±標準誤差，n＝5.8，＊p＜0.05,vs.Saline．いる7）．また，皮膚炎などのアレルギー防止作用を有することも見出され，生物化学領域においても注目されている8,9）．筆者らもこれまで，このセリシン溶液点眼により角膜傷害治癒促進効果がみられ，1.5％のセリシン溶液が角膜傷害治療薬として有用であることを見出してきた10）．さらに，BACとセリシン併用によりBACの角膜傷害性が緩和され，0.1％のセリシンを用いることで，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発に繋がる可能性を報告してきた6）．本研究では，点眼用保存剤BACとこのセリシンからなるBAC-セリシン点眼用保存システムの開発研究として，ウサギ赤血球モデルを用い，セリシンのBAC細胞傷害保護効果について検討を行った．赤血球は，両面中央が凹んだ円盤状の形をしており，核を持たないことから細胞分裂などを行わないのが特徴である．このため，赤血球を用いることで，薬剤自身の直接的な刺激性やそれに対する保護作用の評価が可能である．そこで今回，この赤血球モデルを用いて浸透圧およびBAC刺激に対するセリシンの細胞保護効果を評価した．まず，浸透圧刺激に対するセリシンの細胞保護効果を検討したところ，等張時，赤血球の溶血はみられなかったが，浸透圧を下げていくことで溶血が認められた．また，セリシンを併用処理することで，赤血球溶血の保護効果がみられ，これら保護効果は濃あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014731度依存的であった．点眼用保存剤として用いられるBAC刺激に対するセリシンの細胞保護効果を検討したところ，本実験条件において，7μg/ml以上のBAC刺激により溶血が認められ，8μg/mlBAC刺激時の溶血率は23.3％，10μg/mlBAC刺激では90.1％の溶血率であった．さらに，浸透圧刺激と同様，セリシン併用処理はBAC刺激に対しても細胞傷害保護効果を示し，8μg/mlBAC刺激時では溶血はほとんど認められず，10μg/mlBAC刺激では非処理群のそれの17.5％であった．また，BAC刺激に対してもセリシンによる保護効果は濃度依存的であった．これらの結果から，セリシンはBACだけでなく，浸透圧などの外部刺激に対しても細胞保護効果を有し，併用処理により細胞傷害を有する点眼製剤の毒性軽減に有用であることが示唆された．一方，セリシンを前処理した際には，浸透圧およびBAC刺激に対するセリシンの保護効果はみられず，セリシン前処理群と未処理群間で浸透圧，BAC刺激に対し同様の溶血性を示した．これら前処理によりセリシンの細胞保護効果が得られなかった理由として，セリシンによる保護効果が細胞膜の活性化によるものではなく，刺激因子に対する直接的な抵抗性増加に起因するためと考えられた．筆者らはこれまで，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発を目指した研究にて，invivoおよびinvitro細胞傷害性評価実験系を確立し11,12），BACへのセリシン添加が，BAC本来の使用目的である保存効果，主薬の角膜透過性亢進能および主薬の薬効に対し影響を及ぼさないことを報告してきた6）．これら以前および今回の結果から，BAC/セリシン点眼用保存システムはBACの角膜上皮傷害性を抑制するとともに，点眼用保存剤として十分な高い保存効力を有し，主成分の角膜透過性および薬効に影響を及ぼさず，またBACの細胞傷害抑制機構の一つに，セリシンの膜保護能が関わっているものと考えられた．本報告は目に優しく長期連続使用可能な保存剤を開発するうえで有用であるものと考えられる．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）川嶋洋一：点眼薬の設計思想．眼科NewInsight第2巻点眼薬─常識と非常識─（木下茂ほか）．p6，メジカルビュー社，19942）WhitsonJT,VarnerDL,NetlandPA：Glaucomadrugsandtheocularsurface.RevOphthalmol11：69-77,20063）PisellaPJ,PouliquenP,BaudouinC：Prevalenceofocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservativefreeglaucomamedication.BrJOphthalmol86：418-423,20024）JaenenN,BaudouinC,PouliquenPetal：Ocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservative-freeglaucomamedications.EurJOphthalmol17：341-349,20075）湖崎惇，大谷伸一郎，鵜木一彦ほか：トラボプロスト点眼液の臨床使用成績眼表面への影響．あたらしい眼科26：101-104,20096）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Decreaseincornealdamageduetobenzalkoniumchloridebytheadditionofsericinintotimololmaleateeyedrops.JOleoSci62：159166,20137）DashR,AcharyaC,BinduPCetal：Antioxidantpotentialofsilkproteinsericinagainsthydrogenperoxide-inducedoxidativestressinskinfibroblasts.BMBRep41：236241,20088）TsubouchiK,IgarashiY,TakasuYetal：Sericinenhancesattachmentofculturedhumanskinfibroblasts.BiosciBiotechnolBiochem69：403-405,20059）TeradaS,NishimuraT,SasakiMetal：Sericin,aproteinderivedfromsilkworms,acceleratestheproliferationofseveralmammaliancelllinesincludingahybridoma.Cytotechnology40：3-12,200210）NagaiN,MuraoT,ItoYetal：EnhancingeffectsofsericinoncornealwoundhealinginOtsukaLong-EvansTokushimaFattyratsasamodelofhumantype2diabetes.BiolPharmBull32：1594-1599,200911）NagaiN,MuraoT,OeKetal：Invitroevaluationforcornealdamagesbyanti-glaucomacombinationeyedropsusinghumancornealepithelialcell（HCE-T）.YakugakuZasshi131：985-991,201112）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,2010＊＊＊732あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014（106）

0910-1810/10/\100/頁/JCOPY（89）1721《原著》あたらしい眼科27（12）：1721.1726，2010cはじめにラタノプロストはプロスタノイドFP受容体と高い親和性をもつプロスタグランジンF2a（以下，PGF2a）誘導体である．PGF2a誘導体を有効成分とするPG関連薬は，緑内障病型を選ばない強い眼圧下降効果があり，全身副作用が少ないことから，近年では世界的に第一選択薬として高く評価されている．しかし，PG関連薬は結膜充血，角膜炎，色素沈着，刺激感などの局所的副作用をひき起こすことが指摘されている．これらの局所的副作用は主剤であるPGF2a誘導体自体の影響のほかに，点眼液中に含まれる防腐剤の細胞毒性およびアレルギー反応が関与しているとされている1）．点眼液に使用される防腐剤のなかでも，溶解性が良く，抗菌力および防腐力が強いベンザルコニウム塩化物が頻用されており，0.001～0.02％の濃度で使用されている2）．しかし，ベンザルコニウム塩化物は防腐剤としての高い有用性をもつ反面，角結膜の上皮細胞に対する細胞毒性があり2,3），それによる眼表面への障害が問題視されている4）．また，ベンザルコニウム塩化物の細胞毒性作用にはアポトーシスが関与していることが示唆されている3,5）．ラタノプロスト点眼液0.005％「サワイ」（以下，ラタノプ〔別刷請求先〕伊田昌弘：〒532-0003大阪市淀川区宮原5-2-30沢井製薬株式会社学術部Reprintrequests：MasahiroIda,MedicalInformationDepartment,SawaiPharmaceuticalCo.,Ltd.,5-2-30Miyahara,Yodogawa-ku,Osaka532-0003,JAPANラタノプロスト点眼液0.005％「サワイ」の角結膜障害性の評価小倉岳治＊1片岡博文＊1大坪義和＊1伊藤吉將＊2＊1沢井製薬株式会社生物研究部＊2近畿大学薬学部製剤学研究室EvaluationofCorneoconjunctivalDamagefromLatanoprostEyedrops0.005％「SAWAI」TakeharuOgura1），HirofumiKataoka1），YoshikazuOhtsubo1）andYoshimasaIto2）1）BiologicalResearchDepartment,SawaiPharmaceuticalCo.,Ltd.,2）LaboratoryofAdvancedDesignforPharmaceuticals,SchoolofPharmacy,KinkiUniversity眼表面への局所的副作用を考慮して開発されたジェネリック医薬品であるラタノプロスト点眼液0.005％「サワイ」について，invivoおよびinvitroにおける細胞毒性およびアポトーシス誘導能を測定し，角結膜障害性を評価した．本点眼液をヒト結膜由来の培養細胞に曝露したところ，細胞生存率は経時的に低下したが，対照品であるキサラタンR点眼液0.005％と比して高い生存率であった．また，細胞核の凝集は軽度で，断片化DNA量の増加は認められなかった．さらに，ウサギにラタノプロスト点眼液0.005％「サワイ」を頻回点眼したところ，結膜上皮層のTUNEL（TdTmediateddUTP-biotinnick-endlabeling）陽性細胞の増加は認められず，単回点眼後の涙液中へのグルタチオン漏出も認められなかった．以上の結果，ラタノプロスト点眼液0.005％「サワイ」の細胞毒性およびアポトーシス誘導能は低く，角結膜障害性は低いと考えられた．Corneoconjunctivaldamagecausedbythegenericformulationoflatanoprost,Latanoprosteyedrops0.005％「SAWAI」,wasevaluatedonthebasisofcytotoxicityandpro-apoptoticeffectsinhumanconjunctivalcellsinvitro,andinrabbitsinvivo.Invitro,thetestformulationtriggeredcelldeathofChangconjunctivacells,thoughlessthanwiththebrandedformulation,XalatanReyedrops0.005％.NoDNAfragmentationandlessevidentnuclearcondensationwereobservedincellstreatedwiththetestformulation.Invivo,frequentinstillationofthetestformulationtorabbiteyeshadnoeffectonthenumberofTUNEL-positivecellsintheepitheliallayeroftheconjunctiva.Exudationofglutathioneintotearfluidwasnotincreasedbysingleinstillationofthetestformulation.TheseresultssuggestthatLatanoprosteyedrops0.005％「SAWAI」causeslesscorneoconjunctivaldamage.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（12）：1721.1726,2010〕Keywords：ラタノプロスト，角結膜障害，細胞毒性，アポトーシス，ベンザルコニウム塩化物．latanoprost,corneoconjunctivaldamage,cytotoxicity,apoptosis,benzalkoniumchloride.1722あたらしい眼科Vol.27，No.12，2010（90）ロスト点眼液「サワイ」）は1mL中にラタノプロスト50μgを含有する点眼液であり，先発医薬品であるキサラタンR点眼液0.005％（以下，キサラタンR点眼液）と同一の有効成分を同量含有するジェネリック医薬品として開発された6）．両製剤はともに防腐剤としてベンザルコニウム塩化物を含有するが，ラタノプロスト点眼液「サワイ」は角結膜障害を考慮し，ベンザルコニウム塩化物を減量して処方設計されている．そこで，新たに筆者らが開発したラタノプロスト点眼液「サワイ」について，角結膜に対する障害性を評価することを目的として，ヒト成人結膜由来細胞株およびウサギを用いて，細胞毒性およびアポトーシス誘導能を測定し，角結膜障害性を評価したので報告する．I実験材料および方法1.被験物質ラタノプロスト点眼液「サワイ」（沢井製薬），キサラタンR点眼液（ファイザー）を用いた．陰性対照としてinvitroではEagle’sminimumessentialmedium（以下，EMEM,Sigma），invivoではリン酸緩衝生理食塩水（以下PBS,和光純薬）を，陽性対照として0.02％ベンザルコニウム塩化物（和光純薬）を用いた．2.使用細胞ヒト成人結膜由来細胞であるChangconjunctiva細胞はDSファーマバイオメディカルより入手した．細胞は50IU/mLペニシリン（Invitorogen），50μg/mLストレプトマイシン（Invitorogen）および10％ウシ胎児血清（BioWhittaker）を添加したEMEMにて培養し，各試験には対数増殖期の細胞を用いた．3.使用動物12週齢の雄性NZWウサギを日本エスエルシーより入手し，馴化飼育の後，試験に用いた．なお，動物実験はすべて沢井製薬動物実験倫理委員会により承認され，動物実験承認規定に準拠し実施した．4.Invitro細胞毒性試験96穴マイクロプレートにChangconjunctiva細胞を20,000cells/wellで播種し，コンフルエントになるまで培養した．培養上清を除去し，PBSで1回洗浄し，被験物質を50μL添加した．37℃で5～30分間インキュベート後，薬液を除去し，PBSで2回洗浄し，MTS法（CellTiter96AQueousOneSolution,Promega）にて490nm（対照640nm）の吸光度を測定することにより生存細胞を測定した．生存率は下式より算出した．なお，試験は5回くり返し実施した．生存率（％）＝（処理群の吸光度）÷（陰性対照の吸光度）×1005.細胞核の形態学的観察Changconjunctiva細胞をチャンバースライド（8well,BDFalcon）に45,000cells/wellで播種し，コンフルエントになるまで培養した．PBSで1回洗浄後，被験物質を100μL添加し，37℃で20分間インキュベートした．PBSで2回洗浄後，4％ホルマリンで固定し，10μg/mLDAPI（4￠,6-diamidino-2-phenylindole，同仁化学）を添加した後，蛍光顕微鏡下にて核の形態学的観察を行った．6.細胞内断片化DNA量の測定細胞内の断片化DNAは，細胞DNAフラグメンテーションELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay；酵素免疫測定法）キット（Roche）を用いて測定した．Invitro細胞毒性試験と同様に96穴プレートに培養したChangconjunctiva細胞にBrdU（bromodeoxyuridine；ブロモデオキシウリジン）を10μMとなるように添加し，18時間培養した．PBSで洗浄後，被験物質を50μL添加し，37℃で20分間インキュベートした．氷冷したPBSを150μL添加し，3,500rpmで1分間遠心後，上清を除去し，細胞溶解液を200μL添加した．室温で30分間インキュベート後，3,500rpmで10分間遠心し，上清中の断片化DNA量をELISAにて測定した．なお，試験は5回くり返し実施した．7.頻回点眼後のウサギ結膜におけるアポトーシス誘導能の測定ウサギに被験物質50μLを5分ごとに10回点眼し，24時間後にペントバルビタールの過剰投与による致死後，結膜を摘出した．摘出結膜は10％中性緩衝ホルマリン溶液で固定後，作製した薄切標本について，InsituApoptosisDetectionKit（タカラバイオ）を用いてTUNEL染色後，ヨウ化プロピジウム（同仁化学）で対比染色した．TUNEL陽性細胞を蛍光顕微鏡下でカウントし，結膜上皮層面積当たりの数を算出した．試験にはウサギ20羽の両眼，計40眼を使用し，各群5例で実施した．8.単回点眼後のウサギ涙液中グルタチオン濃度の測定ウサギに被験物質200μLを結膜.内に点眼し，薬液が流出しないように下瞼を引きながら1分間保持した．貯留する涙液をマイクロピペットで採取し，グルタチオン（以下，GSH）濃度を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法にて測定した．涙液70μLに内部標準溶液（1μg/mLシステアミン）20μLおよびジチオストレイトール10μL（終濃度0.1mM）を添加し，室温で30分間インキュベートし還元した．発蛍光試薬として1mMABD-Fを100μL添加し，50℃で5分間インキュベート後，0.1MHClを60μL添加し反応を停止した．この反応液について，逆相HPLC法（使用カラム：ImtaktCadenzaCD-C18100×4.6mm3μm，蛍光検出：EX380nm/EM510nm）にて涙液中総GSH濃度を定量した．試験にはウサギ3羽の両眼，計6眼を使用した．試（91）あたらしい眼科Vol.27，No.12，20101723験は4×4クロスオーバー法で実施し，1週間の休薬期間をおいてPBS，ベンザルコニウム塩化物，続いてラタノプロスト点眼液「サワイ」またはキサラタンR点眼液の順に点眼した．II結果1.Invitro細胞毒性試験図1にヒト結膜細胞に点眼液を曝露した際の生存率の経時的変化を示した．キサラタンR点眼液を曝露すると5分後に生存率は9.8％となり，生存率は急激に低下した．また，0.02％ベンザルコニウム塩化物を曝露した場合も同様の時間的推移を示し，急激に生存率が低下した．それに対し，ラタノプロスト点眼液「サワイ」では5，10および20分後の生存率はそれぞれ78.9％，76.8％および41.2％で，30分後には15.7％まで減じるものの，いずれの時点においてもキサラタンR点眼液よりも高い生存率であった．2.細胞核の形態学的変化ヒト結膜細胞にキサラタンR点眼液および0.02％ベンザルコニウム塩化物を曝露すると，顕著な核の凝集が認められた0255075100曝露時間（分）051015202530生存率（％ofControl）図1ヒト結膜由来細胞における細胞毒性試験（5例平均±SD）培養細胞を各被験物質に曝露後，経時的に生細胞をMTS法にて測定した．●：ラタノプロスト点眼液「サワイ」，○：キサラタンR点眼液，×：0.02％ベンザルコニウム塩化物．A．コントロール（EMEM）B．ラタノプロスト点眼液「サワイ」C．キサラタンR点眼液D．0.02％ベンザルコニウム塩化物図2ヒト結膜由来細胞における核の形態学的変化培養細胞を各被験物質に20分間曝露後，DAPI（4￠,6-diamidino-2-phenylindole）染色した．1724あたらしい眼科Vol.27，No.12，2010（92）（図2CおよびD）．これに対し，ラタノプロスト点眼液「サワイ」を曝露した際は，一部の細胞で核の凝集が認められるものの，凝集度は軽度であった（図2B）．3.細胞内断片化DNA量図3に示したように，ヒト結膜細胞にラタノプロスト点眼液「サワイ」を曝露しても，細胞内の断片化DNA量に変化は認められなかった．それに対し，キサラタンR点眼液を曝露すると有意な断片化DNAの増加が認められた．4.頻回点眼後のウサギ結膜におけるアポトーシス誘導能5分ごとに10回連続点眼後のウサギ結膜をTUNEL染色し，アポトーシス細胞を測定した（図4）．キサラタンR点眼液および0.02％ベンザルコニウム塩化物点眼群では，コントロールと比して有意なTUNEL陽性細胞の増加が認められた．それに対し，ラタノプロスト点眼液「サワイ」点眼群ではTUNEL陽性細胞の増加は認められなかった．5.単回点眼後のウサギ涙液中GSH濃度単回点眼後のウサギ涙液中の総GSH濃度を測定した（図5）．キサラタンR点眼液および0.02％ベンザルコニウム塩化物点眼群では，コントロールと比して有意な涙液中GSH濃度の増加が認められた．それに対し，ラタノプロスト点眼液「サワイ」点眼群では涙液中GSH濃度の増加は認められなかった．III考按緑内障は特徴的な視神経の変化と視野欠損を呈する進行性の疾患である．その原因はさまざまであるが，緑内障進行の最大のリスクファクターは眼圧であり，眼圧を下降させることが緑内障治療の基本となっている．眼圧下降治療は薬物治療が基本であり，薬剤選択のポイントには最小限の薬剤で設定した目標眼圧を達成できるような薬理学的側面がある一方，副作用，年齢，社会的経済的な側面も考慮して患者のqualityoflife（QOL）を損ねない配慮も必要である7）．局所的副作用の側面として，PG関連薬では結膜充血，角膜上皮障害，しみるなどの刺激症状などが高頻度で起こることが知られている．このような局所的副作用は有効成分のほか，点眼液に含まれる添加物，特に防腐剤が原因となっている2,3）．緑内障における点眼治療は生涯にわたって継続し，目標眼圧の達成に多剤併用を必要とすることも多く，これらの多面的要因により薬剤の変更や治療の中止を余儀なくされる場合もある．点眼液は主薬の有効性，溶解性および安定性のほか，刺激性，無菌性などさまざまな因子を考慮し，可溶化剤，等張化剤，pH調節剤，防腐剤など添加物を用いて処方設計される．キサラタンR点眼液のジェネリック医薬品であるラタノプロスト点眼液「サワイ」はこれらの添加物を効率よく配合することにより，キサラタンR点眼液と同等の眼圧下降作用を有しながら6），安定性を向上させて室温保存を可能とした．さらに添加物のなかでも局所的副作用のおもな原因であるベンザルコニウム塩化物の濃度を減じ，かつ防腐剤としての効力を十分に発揮させることを可能とした．そこで，本研究ではラタノプロスト点眼液「サワイ」の角結膜における局所的副作用を評価することを目的とし，invivoおよびinvitroにおける細胞毒性およびアポトーシス誘導能を測定した．Invitroでヒト結膜細胞にラタノプロスト点眼液「サワイ」およびキサラタンR点眼液を曝露した際，いずれの群においても細胞死が誘導された．しかし，ラタノプロスト点眼液「サワイ」ではキサラタンR点眼液と比較して細胞生存率は高率であった．また，ラタノプロスト点眼液「サワイ」による長時間の曝露でも顕著な生存率の低下が認められたが，これは高濃度の薬剤を長時間曝露した場合であり，ヒトに点眼した場合は点眼刺激による涙液分泌増加のために薬剤濃度が速やかに希釈され，余剰な薬剤は流出すること，さらには涙液交換率が約17％/分2）であることを考慮すると，臨床上，細胞の生死にはほとんど影響を与えないと考えられる．Invivoにおける細胞毒性の指標として涙液中GSH濃度を測定した．GSHは涙液腺からは分泌されないが，角結膜に多量に含有されており，角結膜組織の物理的，生化学的，生理学的な変化によりその表面や内部から流出するため，流出したGSH量が角結膜の障害性を反映すると考えられている8）．ウサギにキサラタンR点眼液を単回点眼した際，涙液中のGSH濃度の有意な増加が認められたが，ラタノプロスト点眼液「サワイ」では認められなかった．これらの結果から，本点眼液はキサラタンR点眼液と比較して細胞毒性は低く，角結膜組織への障害性は軽減されていると考えられた．0.250.200.150.100.050.00吸光度＃＃＃＃＊＊コントロール（EMEM）ラタノプロスト点眼液「サワイ」キサラタンR点眼液0.02％BAC図3ヒト結膜由来細胞における細胞内断片化DNA量の比較（5例平均±SD）培養細胞を各被験物質に20分間曝露後，ELISAにて細胞内の断片化DNA量を測定した．BAC：ベンザルコニウム塩化物．##：p＜0.01vsControlbyDunnetttest，＊＊：p＜0.01byttest．（93）あたらしい眼科Vol.27，No.12，20101725ベンザルコニウム塩化物は角膜上皮細胞や結膜上皮細胞のアポトーシスを誘導することが知られている．ベンザルコニウム塩化物を含有する点眼液でも同様の報告があり，これが点眼液による細胞毒性の機序の一つと考えられている3,5）．本研究で用いたinvivoでウサギに頻回点眼するモデルは，点眼液の毒性の有無を鋭敏に評価できるとされており，キサA．コントロール（PBS）B．ラタノプロスト点眼液「サワイ」C．キサラタンR点眼液D．0.02％ベンザルコニウム塩化物E．TUNEL陽性細胞数（5例平均±SD）6005004003002001000TUNEL陽性細胞（個/mm2）＃＃＃＊コントロール（PBS）ラタノプロスト点眼液「サワイ」キサラタンR点眼液0.02％BAC図4頻回点眼後のウサギ結膜のTUNEL染色像5分ごと10回点眼し，24時間後に結膜を採取してTUNEL染色（緑）およびPI（ヨウ化プロビジウム）染色（赤）した．BAC：ベンザルコニウム塩化物．#，##：p＜0.05,0.01vsControlbyDunnetttest，＊：p＜0.05byt-test．6.05.04.03.02.01.00.0涙液中グルタチオン（μg/mL）＃＃＃＃＊＊コントロール（PBS）ラタノプロスト点眼液「サワイ」キサラタンR点眼液0.02％BAC図5単回点眼後の涙液中グルタチオン濃度（6例平均±SD）結膜.内に各被験物質を1分間貯留させ，貯留液中の総グルタチオン濃度を測定した．BAC：ベンザルコニウム塩化物．##：p＜0.01vsControlbyDunnetttest，＊＊：p＜0.01byt-test．1726あたらしい眼科Vol.27，No.12，2010（94）ラタンR点眼液あるいはベンザルコニウム塩化物の点眼により，角結膜における炎症反応の惹起およびアポトーシスの誘導が報告されている5,9）．しかし，ラタノプロスト点眼液「サワイ」を頻回点眼してもアポトーシス（TUNEL陽性）細胞数の増加は認められなかった．また，invitroでヒト結膜細胞に曝露しても，アポトーシスの指標となる核の凝集は軽度で，DNAの断片化は認められなかった．これらの結果から，ラタノプロスト点眼液「サワイ」による結膜上皮細胞に対するアポトーシス誘導能は低いものと考えられた．ラタノプロスト点眼液「サワイ」に使用されているベンザルコニウム塩化物以外の添加物（トロメタモール，クエン酸，d-マンニトール，グリセリン，ヒプロメロースおよびポリソルベート80）について，ヒト結膜細胞における細胞毒性試験を実施した結果，いずれの添加物についても本点眼液に含有する濃度では細胞毒性は認められなかった（データ示さず）．各添加物の相互作用あるいは保護作用などの影響は未知であるが，本点眼液はキサラタンR点眼液に対し，ベンザルコニウム塩化物濃度を約半分へ減じており，両製剤の細胞毒性およびアポトーシス誘導能の差異は，ベンザルコニウム塩化物含有量の違いがその一因と考えられる．本研究はヒト結膜細胞を用いたinvitro試験およびウサギを用いたinvivo試験の結果であり，まだ臨床的な検証はされていない．しかし，本研究の結果は点眼液の処方を検討することにより，細胞毒性を軽減させることが可能であることを示しており，同一主薬の製剤でも同等の効果を維持しながら，臨床使用における角結膜障害リスクを低減させることが可能であることを示唆している．点眼液の処方設計と局所的副作用に関する臨床的な検証はまだ不十分であり，今後のさらなる検討が必要である．以上，ヒト結膜由来細胞およびウサギを用いてラタノプロスト点眼液「サワイ」の角結膜障害性を評価した結果，その細胞毒性およびアポトーシス誘導能は低く，角結膜障害性は低いと考えられた．また，本検討で行ったいずれの試験においても，本点眼液の毒性は対照に用いたキサラタンR点眼液と比して軽度であった．よって，ラタノプロスト点眼液「サワイ」は角結膜障害発生のリスク低減という意味で有用性が期待できると考えられた．文献1）相良健：オキュラーサーフェスへの影響─防腐剤の功罪．あたらしい眼科25：789-794,20082）中村雅胤，西田輝夫：防腐剤の功罪．眼科NewInsight2点眼薬─常識と非常識（大橋裕一編），p36-43,メジカルビュー社，19943）GuenounJM,BaudouinC,RatPetal：Invitrostudyofinflammatorypotentialandtoxicityprofileoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostinconjunctiva-derivedepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci46：2444-2450,20054）PisellaPJ,PouliquenP,BaudouinC：Prevalenceofocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservativefreeglaucomamedication.BrJOphthalmol86：418-423,20025）LiangH,BaudouinC,PaulyAetal：Conjunctivalandcornealreactionsinrabbitsfollowingshort-andrepeatedexposuretopreservative-freetafluprost,commerciallyavailablelatanoprostand0.02％benzalkoniumchloride.BrJOphthalmol92：1275-1282,20086）竹内譲，沖田祐佳，上野眞義ほか：ラタノプロスト点眼液0.005％「サワイ」の健康成人における薬力学的試験．診療と新薬47：298-303,20107）相原一：緑内障点眼薬─選択のポイント．あたらしい眼科25：751,20088）開繁義，石田俊郎，狩野真由美：涙液の生化学的分析による眼局所用薬剤の角膜障害性の評価．日眼会誌92：1553-1564,19889）LiangH,Brignole-BaudouinF,Rabinovich-GuilattLetal：Reductionofquaternaryammonium-inducedocularsurfacetoxicitybyemulsions：aninvivostudyinrabbits.MolVis14：204-216,2008＊＊＊

0910-1810/10/\100/頁/JCOPY（119）691《原著》あたらしい眼科27（5）：691.694，2010cはじめに0.0015％タフルプロスト点眼液（タプロスR点眼液0.0015％，以下タフルプロスト）は，旭硝子株式会社と参天製薬株式会社の共同で開発された日本発のプロスタグランジンF2a誘導体を含有する点眼剤で，緑内障・高眼圧症治療剤として良好な眼圧下降効果だけでなく，眼血流改善効果が期待されている薬剤として2008年12月に発売された．緑内障は視野異常が生じる視神経の疾患であるが，眼圧下降が唯一エビデンスのある治療方法であり，眼圧下降剤の点眼と手術によって治療される1）．眼圧下降剤の点眼は長期にわたること，また眼圧をコントロールするために多剤併用される傾向にあることから，各点眼液に含まれる添加物による角膜上皮の障害が問題とされることがある．点眼液の代表的な添加剤であるベンザルコニウム塩化物（BAK）は，角膜状〔別刷請求先〕深野泰史：〒630-0101生駒市高山町8916-16参天製薬株式会社研究開発センターReprintrequests：YasufumiFukano,Research&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.,8916-16Takayama-cho,Ikoma,Nara630-0101,JAPANベンザルコニウム塩化物を低減した新処方タフルプロスト点眼液の眼内移行性および眼圧下降作用深野泰史小谷敬子中村雅胤河津剛一参天製薬株式会社研究開発センターIntraocularPenetrationandIntraocularPressure-LoweringEffectofNewFormulation0.0015％TafluprostOphthalmicSolutionwithReducedBenzalkoniumChlorideYasufumiFukano,NorikoOdani-Kawabata,MasatsuguNakamuraandKouichiKawazuResearch&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.目的：ベンザルコニウム塩化物（BAK）濃度を低減した新処方タフルプロスト点眼液を点眼したときのタフルプロストの眼内移行性および眼圧下降作用を，現処方と比較検討した．方法：タフルプロスト点眼後の眼内移行性は，雄性日本白色ウサギを用いて角膜，房水および虹彩毛様体中のタフルプロストカルボン酸体（タフルプロストの活性本体）濃度を測定し評価した．眼圧下降作用の評価は雄性正常眼圧サルを用いて実施した．結果：タフルプロスト点眼後の角膜，房水および虹彩毛様体中タフルプロストカルボン酸体濃度の最高濃度（Cmax），消失半減期（T1/2）および組織中濃度-時間下曲線面積（AUC）は処方間でほぼ同じであり，房水移行性も同等であった．眼圧下降作用も強度，経時変化ともに処方間に違いはみられなかった．結論：タフルプロストの眼内移行性および眼圧下降作用は，BAK濃度の影響を受けることなく，現処方と新処方でほぼ同じであった．Thepurposeofthisstudywastoevaluatetheinfluenceofbenzalkoniumchloride（BAK）concentrationin0.0015％tafluprostophthalmicsolution（TaprosR0.0015％）onthepenetrationoftafluprostacid,thepharmacologicalactivemetabolite,intoeyetissuesinrabbits,andtoassessitsintraocularpressure（IOP）-loweringeffectinmonkeys.Currentandnew（reducedBAKconcentration）formulationsweretopicallydosedontorabbitormonkeyeyes.Pharmacokineticprofilesoftafluprostacidinrabbitcornea,aqueoushumorandiris-ciliarybodydidnotshowanysignificantdifferencebetweenthetwoformulations.Themaximumconcentrationoftheacidinrabbitaqueoushumorforthenewformulationwasstatisticallyequivalenttothatforthecurrentformulation.ComparisonoftheformulationsastotheireffectonIOPinmonkeysdemonstratedsimilarresultsforbothdiurnalIOPandmaximumIOPreduction.Inconclusion,thenewformulationoftafluprostophthalmicsolutionwithreducedBAKisequivalenttothecurrentformulationintermsofbothpharmacokineticsandefficacy.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（5）：691.694,2010〕Keywords：タフルプロスト，ベンザルコニウム塩化物，眼内移行性，眼圧下降作用．tafluprost,benzalkoniumchloride,intraocularpenetration,intraocularpressureloweringeffect.692あたらしい眼科Vol.27，No.5，2010（120）態の変化や炎症などの角膜上皮障害を誘発するポテンシャルを有することが多数報告されている2.5）．一方，点眼剤の品質保持のためには，容器などで工夫された製剤でない限り防腐剤は必要である．そこで，角膜への安全性と防腐効力のバランスがとれた防腐剤と防腐剤濃度を設定する処方が必要とされる．今回，タフルプロスト点眼液中に含有されるBAK濃度を見直し，防腐効果と角膜安全性の両面からバランスのとれた濃度6）に低減する新処方を見出した．本研究では，眼内移行動態，眼圧下降作用の両観点より，現処方と新処方の比較検討を行った．I実験材料1.点眼液試験には，参天製薬で製造された現処方タフルプロスト（タフルプロスト0.0015％含有）およびBAK濃度を現処方の1/10に低減した新処方タフルプロスト（タフルプロスト0.0015％含有）を用いた．2.測定用標準物質測定用標準物質として使用したタフルプロストカルボン酸体および内標準物質は，旭硝子株式会社にて合成された．3.実験動物眼内移行動態試験には，日本白色ウサギ（雄性）を使用した．眼圧試験には，正常眼圧カニクイザル（Macacafascicularis，雄性）を使用した．本研究は，「動物実験倫理規程」，「参天製薬（株）の動物実験における倫理の原則」，「動物の苦痛に関する基準」などの参天製薬株式会社社内規程を遵守し，実施した．II実験方法1.眼内移行性評価日本白色ウサギ（雄性）の同一個体の左眼に現処方，右眼に新処方タフルプロストをそれぞれ50μlずつ単回点眼し，点眼後15，30分，1，2，4および8時間に角膜，房水および虹彩毛様体を採取した（各時点4例）．点眼後のタフルプロストは速やかにタフルプロストカルボン酸体（タフルプロストの活性本体）に代謝される7）ことから，眼内移行性評価には眼組織中タフルプロストカルボン酸体濃度を液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析計（LC-MS/MS）を用いて測定した．組織中タフルプロストカルボン酸体濃度の薬物動態パラメータは，平均組織中濃度より算出した．房水移行の同等性は，点眼後30分における房水中タフルプロストカルボン酸体濃度について，90％信頼区間法により確認した（各処方14例）．生物学的同等性は，房水中タフルプロストカルボン酸体濃度の対数値について二元配置分散分析を行い，残差の平均平方を用いて算出した現処方点眼時に対する新処方点眼時の差の90％信頼区間がlog（0.80）.log（1.25）を満たすとき，同等と判断した．2.現処方あるいは新処方タフルプロスト点眼後の眼圧測定試験には，無麻酔下での眼圧測定に対し十分馴化されたことを確認した正常眼圧の雄性カニクイザルを使用した．現処方タフルプロスト，新処方タフルプロスト，現処方基剤，あるいは新処方基剤を1群8例の雄性正常眼圧サルの片眼に20μl単回点眼し眼圧を測定した．眼圧は，点眼直前ならびに点眼後2，4，6および8時間に，圧平式眼圧計を使用して盲検下で測定した．眼圧下降作用は，点眼後の各眼圧測定時間の眼圧値から点眼直前の眼圧値を引いた眼圧下降幅のなかの最大値である最大眼圧下降幅で評価した．III結果1.眼内移行性現処方および新処方タフルプロスト点眼後の角膜，房水および虹彩毛様体中タフルプロストカルボン酸体濃度推移および薬物動態パラメータを，図1および表1に示す．タフルプロストカルボン酸体は，角膜および虹彩毛様体では点眼後1または2時間まで，房水では点眼後4時間まで定量可能であった．タフルプロストカルボン酸体濃度は角膜では点眼後15分，房水および虹彩毛様体では点眼後30分に最高となり，その後時間経過に従って消失し，いずれの処方でもほぼ同様な推移を示した．また，薬物動態パラメータである最高濃度（Cmax），消失半減期（T1/2）および組織中濃度-時間下曲線面積（AUC）も処方間でほぼ同じであった．点眼後30分における房水中タフルプロストカルボン酸体濃度により，房水移行の同等性を確認したところ，房水中タフルプロストカルボン酸体濃度は，現処方で6.10±2.38ng/ml，新処方で5.52±1.13ng/mlであった（平均値±標準偏差）．これら房水中タフルプロストカルボン酸体濃度の対数値について，処方および個体を要因とする二元配置分散分析を行った．現処方点眼時に対する新処方点眼時の差の90％信頼区間はlog（0.829）.log（1.096）であり，生物学的同等性の基準〔log（0.80）.log（1.25）〕を満たし，両処方のタフルプロストカルボン酸体房水移行性は同等であると判断できた．2.眼圧下降作用正常眼圧サルにおける各点眼群の最大眼圧下降幅（点眼前後の眼圧差の最大値）を図2に，眼圧実測値の経時変化を図3に示す．現処方タフルプロスト点眼群は，正常眼圧サルに対して眼圧下降作用を示し，その最大眼圧下降幅は2.2±0.5mmHg（平均値±標準誤差）で，現処方基剤群（0.6±0.1mmHg）に比し有意であった．新処方タフルプロスト点眼群は，新処方基剤群（0.5±0.1mmHg）に比し有意な眼圧下降作用を認め，その最大眼圧下降幅は2.5±0.7mmHgであった．現処方タフルプロスト点眼群と新処方タフルプロスト点眼群の最大眼圧下降幅は，2群間で統計学的な有意差は認められなかった．また，眼圧実測値の経時変化においても処方間で明確な違いはみられなかった．（121）あたらしい眼科Vol.27，No.5，2010693以上の結果から，タフルプロスト点眼液の現処方と新処方の眼圧下降作用に明確な差は認められなかった．IV考按本研究において，タフルプロスト点眼液中のBAK濃度の低減化は，タフルプロストカルボン酸体の眼内移行性に影響を与えなかった．この結果は，両処方間で眼圧下降作用に差がなかったことによっても裏付けられた．一般にBAKは，それ自身の界面活性作用や角膜上皮細胞表1タフルプロスト点眼液現処方および新処方単回点眼後のウサギ眼組織中タフルプロストカルボン酸体濃度の薬物動態パラメータ組織処方Cmax（ng/mlまたはng/g）Tmax（時間）T1/2（時間）AUC0-8hr（ng･hr/mlまたはng/g）AUC0-inf（ng･hr/mlまたはng/g）角膜現処方3070.250.30193189新処方3180.250.54236229房水現処方7.630.50.6712.912.6新処方8.750.50.7714.814.5虹彩毛様体現処方3.070.50.673.673.65新処方5.990.50.866.336.68各値は4例の平均組織中濃度より算出．0A45040035030025020015010050012投与後時間（時間）：現処方：新処方角膜中濃度（ng/g）340B12108642012投与後時間（時間）：現処方：新処方房水中濃度（ng/ml）340C12108642012投与後時間（時間）：現処方：新処方虹彩毛様体中濃度（ng/g）34図1タフルプロスト点眼液現処方および新処方単回点眼後のウサギ眼組織中タフルプロストカルボン酸体濃度推移A：角膜，B：房水，C：虹彩毛様体．各値は4例の平均値±標準偏差を示す．43210現処方基剤新処方基剤NS＊＊現処方タフルプロスト新処方タフルプロスト最大眼圧下降幅（mmHg）図2正常眼圧サルにおけるタフルプロスト点眼液現処方および新処方の単回点眼時の最大眼圧下降幅各値は8例の平均値±標準誤差を示す．＊：p＜0.05（Aspin-Welchのt検定），NS：有意差なし（Studentのt検定）．2019181716150眼圧（mmHg）024点眼からの時間（hr）68：現処方基剤：現処方タフルプロスト：新処方基剤：新処方タフルプロスト図3正常眼圧サルにおけるタフルプロスト点眼液現処方および新処方の単回点眼時の眼圧の経時変化各値は8例の平均値±標準誤差を示す．694あたらしい眼科Vol.27，No.5，2010（122）間隙の拡張作用によって，薬物の角膜透過性を亢進する場合があることが報告されており8.10），タフルプロストと同じプロスタグランジンF2a誘導体であるトラボプロストについても，トラボプロストカルボン酸体のウサギ眼内移行性がBAK含有点眼液に比べて非含有点眼液で低下したことが知られている．しかしながら，トラボプロストのBAK非含有点眼液にはBAKに代えてホウ酸や塩化亜鉛などが添加されており，それによる薬物の眼内移行性への影響は不明であるため，一概にBAK濃度による眼内移行性の変化とは考えられない．筆者らはすでに，ラタノプロスト点眼液点眼後のラタノプロストカルボン酸体のウサギ房水移行性が，BAK0.02％含有および非含有処方間で違いがないことを報告している11）．さらに今回の検討により，タフルプロストについてもタフルプロストカルボン酸体のウサギ房水移行性が，BAKの濃度によらず変化しないことが確認できた．BAKによる角膜透過性亢進の感受性はヒトではウサギよりも低いことが示唆されている12）ことから，プロスタグランジン系点眼液中のBAK濃度は，臨床適用範囲では，活性本体のヒト眼内移行性に影響しないと考える．プロスタグランジンF2a誘導体の眼圧下降反応性は，ウサギでは低くサルで高いことが知られており13），タフルプロストでは正常眼圧サルにおいて点眼液濃度0.0002％.0.005％で，高眼圧サルにおいて点眼液濃度0.0002％.0.0025％で濃度依存的な眼圧下降作用の増強が認められている14）．また，健常人に対して，タフルプロストは0.0025％.0.005％で濃度依存的に眼圧下降作用を示す15）．これらの結果から，サルにおいてはヒトとほぼ同じ濃度範囲で濃度依存的な眼圧下降作用を示すと考えられ，サルはヒトの有効性を比較的よく反映していると考える．本研究において，正常眼圧サルの眼圧下降作用はタフルプロストの現処方と新処方で明確な差はなかった．このことから，ヒトにおいてもタフルプロストの眼圧下降作用に点眼液中BAK濃度は影響せず，タフルプロストの現処方と新処方の眼圧下降作用に差はないと考えられる．以上，現処方とBAK濃度を低減した新処方のタフルプロストを用いて眼内移行動態，眼圧下降作用の両点を比較検討した結果，薬物動態面，薬効面ともにBAK濃度が影響を与えることはなかった．点眼液に含有されるBAKは，炎症や点状角膜表層症などの症状を誘発する原因とも考えられることから，BAK濃度を低減した新処方タフルプロストは，今までと変わらない薬効のうえに，角膜上皮細胞の安全性にも配慮された点眼液6）となることが期待される．謝辞：本研究にご協力をいただいた石田成弘氏，倉島宏明氏，三枝祐史氏，後藤干城氏，寺嶋達雄氏に感謝いたします．文献1）日本緑内障学会緑内障診療ガイドライン作成委員会：緑内障診療ガイドライン（第2版）．日眼会誌110：777-814,20062）BaudouinC,LiangH,HamardPetal：TheocularsurfaceofglaucomapatientstreatedoverthelongtermexpressesinflammatorymarkersrelatedtobothT-helper1andT-helper2pathways.Ophthalmology115：109-115,20083）PisellaPJ,PouliquenP,BaudouinC：Prevalenceofocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservativefreeglaucomamedication.BrJOphthalmol86：418-423,20024）JaenenN,BaudouinC,PouliquenPetal：Ocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservative-freeglaucomamedications.EurJOphthalmol17：341-349,20075）LeungEW,MedeirosFA,WeinrebRN：Prevalenceofocularsurfacediseaseinglaucomapatients.JGlaucoma17：350-355,20086）AsadaH,Takaoka-ShichijoY,NakamuraMetal：Optimizationofbenzalkoniumchlorideconcentrationin0.0015％tafluprostophthalmicsolutionfrompointsofocularsurfacesafetyandpreservativeefficacy.YakugakuZasshi130（6）,20107）FukanoY,KawazuK：Dispositionandmetabolismofanovelprostanoidantiglaucomamedication,tafluprost,followingocularadministrationtorats.DrugMetabDispos37：1622-1634,20098）SasakiH,NaganoT,YamamuraKetal：Ophthalmicpreservativesasabsorptionpromotersforoculardrugdelivery.JPharmPharmacol47：703-707,19959）SasakiH,YamamuraK,MukaiTetal：Enhancementofoculardrugpenetration.CritRevTherDrugCarrierSyst16：85-149,199910）McCareyB,EdelhauserH：Invitrocornealepithelialpermeabilityfollowingtreatmentwithprostaglandinanalogswithorwithoutbenzalkoniumchloride.JOculPharmTher23：445-451,200711）FukanoY,AsadaH,KimuraAetal：Influenceofbenzalkoniumchlorideonthepenetrationoflatanoprostintorabbitaqueoushumorafterocularinstillations.AAPSJ8（S2）,200612）BursteinNL：Preservativealterationofcornealpermeabilityinhumansandrabbits.InvestOphthalmolVisSci25：1453-1457,198513）StjernschantzJW：FromPGF2a-isopropylestertolatanoprost：AreviewofthedevelopmentofXalatan：theProctorLecture.InvestOphthalmolVisSci42：1134-1145,200114）TakagiY,NakajimaT,ShimazakiAetal：PharmacologicalcharacteristicsofAFP-168（tafluprost）,anewprostanoidFPreceptoragonist,asanocularhypotensivedrug.ExpEyeRes78：767-776,200415）SuttonA,GilvarryA,RopoA：Acomparative,placebocontrolledstudyofprostanoidfluoroprostaglandinreceptoragoniststafluprostandlatanoprostinhealthymales.JOculPharmacolTher23：359-365,2007＊＊＊