あたらしい眼科

《原著》あたらしい眼科38（2）：191.196，2021cInvitroにおけるコンタクトレンズに付着した蛋白質に対するソフトコンタクトレンズ用消毒剤のレンズケア効果鈴木崇＊1糸川貴之＊1堀江隆至＊2内田薫＊2堀裕一＊1＊1東邦大学医療センター大森病院眼科＊2日本アルコン株式会社CInvitroCEvaluationofLensCareE.ectofSoftContactLensDisinfectionSolutionontheProteinDepositedContactLensesCTakashiSuzuki1）,TakayukiItokawa1）,TakashiHorie2）,KaoruUchida2）andYuichiHori1）1）DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine,TohoUniversity,2）AlconJapanLtd.C目的：ソフトコンタクトレンズ（SCL）に付着した蛋白質や脂質などの付着物は，眼アレルギー，眼不快感ならびに角膜感染症の原因となるため，SCLから付着物を適切に除去する必要がある．そこで今回，5種類のCSCL用消毒剤を用いて，invitroにおける頻回交換のCSCLに付着した蛋白質のレンズケア効果を検討した．対象および方法：試験コンタクトレンズ（CL）には，SCLのCeta.lconAおよびシリコーンハイドロゲルCCLのCseno.lconAを用いた．涙液組成を模したリン酸緩衝液（PBS）を含んだプラスチック試験管に試験CCLを移し，蛋白質が付着した試験CCLを準備した．過酸化水素剤（HP剤），ポビドンヨード剤（PI剤），3種類のマルチパーパスソリューション（MPS）およびCPBSを用いてCeta.lconAのレンズケアを実施した．レンズケアおよび測定順序をランダム化し，レンズケア時間は各CSCL用消毒剤の最短消毒時間とした．レンズケア後に試験CCLから蛋白質を抽出し，MicroBCAproteinassaykitにて分光光度計で吸光度を測定し，試験CCLに付着した蛋白質量を定量した．結果：試験CCLに付着した蛋白質量は，Cseno.lconAのC7.8C±1.1Cμg/レンズに比べてCeta.lconAはC1,089.0C±98Cμg/レンズと有意に多かった．5種類のCSCL用消毒剤ならびにCPBSでのレンズケア後のCeta.lconAに付着した蛋白質量は，それぞれC528.1C±88Cμg/レンズ，758.1C±155Cμg/レンズ，858.5C±218Cμg/レンズ，730.4C±140Cμg/レンズ，841.1C±257Cμg/レンズ，727.5C±160Cμg/レンズでレンズケア前よりも減少した．5種類のCSCL用消毒剤においては，HP剤に対してCPI剤およびC3種類のCMPS間で有意差を認めた（対応のないCt検定p＜0.05）．結論：InvitroにおけるCeta.lconAに付着した蛋白質はC5種類のCSCL用消毒剤でのレンズケア効果が認められた．HP剤はCPI剤やC3種類のCMPSに比べて，eta.lconAに付着した蛋白質に対するレンズケア効果が有意に優れていることが示された．CObjective：DepositsCsuchCasCproteinsCandClipidsCadheringCtoCsoftCcontactlenses（SCLs）causeCocular-relatedCallergy,discomfortandinfections.Thus,itisnecessarytohavethemappropriatelyremoved.Inthisinvitrostudy,weexaminedthee.ectoflenscareproteinsadheringtofrequentreplacementtypesofSCLbyusing5SCLdisin-fectionCsolutions.CCasesCandCmethods：ThisCstudyCinvolvedCeta.lconCACandCseno.lconCACsiliconeChydrogelCSCLs.CThestudySCLsweretransferredtoaplastictesttubecontainingaphosphatebu.er（PBS）simulatingtearcom-position,CandCaCstudyCSCLCtoCwhichCtheCproteinCwasCattachedCwasCprepared.CLens-careCtestCsolutionsCwereCexam-inedforthehydrogenperoxide（HP）C,thepovidone-iodine（PI）C,3typesofmulti-purposesolutions（MPS）andPBS.Lens-careCofCtheCeta.lconCACSCLsCwasCmadeCwithCdisinfectionCsolutions.CTheClens-careCandCmeasurementCorderCwererandomized,andthelens-caretimewastheshortestdisinfectingtimeofeachdisinfectantusedfortheSCLs.Afterlens-care,theproteinwasextractedfromtheSCLs,andtheabsorbancewasmeasuredandquanti.edbyaspectrophotometerusingaMicroBCAproteinassaykit.Results：TheamountofproteinattachedtostudySCLswasC1089.0±98Cμg/lensforeta.lconA,whichwassigni.cantlyhigherthan7.8±1.1Cμg/lensforseno.lconA.TheamountCofCproteinCadheringCtoCeta.lconCACafterClensCcareCwithCtheC5SCLCdisinfectionCsolutionsCandCPBSCwasC〔別刷請求先〕鈴木崇：〒143-8541東京都大田区大森西C6-11-1東邦大学医療センター大森病院眼科Reprintrequests：TakashiSuzuki,M.D.,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine,TohoUniversity,6-11-1Omori-Nishi,Ohta-ku,Tokyo143-8541,JAPANC528.1±88Cμg/lens,C758.1±155Cμg/lens,C858.5±218Cμg/lens,C730.4±140Cμg/lens,C841.1±257Cμg/lens,CandC727.5±160Cμg/lens,Crespectively.CTheCamountsCofCproteinCadheringCtoCeta.lconCACwasClowerCthanCpriorCtoClensCcare.CRegardingthe5SCLdisinfectionsolutions,astatisticalsigni.cantdi.erencewasdemonstratedamongHP,PIand3CMPS（unpairedt-testp＜0.05）C.Conclusion：InthisinvitroCstudy,lens-caree.ectofproteinattachedtoeta.lconACwasCobservedCwithCtheC5SCLCdisinfectants.CItCwasCshownCthatCHPCwasCsigni.cantlyCsuperiorCtoCPICandCtheC3typesofMPSinregardtothelenscaree.ectontheproteinattachedtoeta.lconA.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）C38（2）：191.196,C2021〕Keywords：ソフトコンタクトレンズ用消毒剤，蛋白質汚れ，過酸化水素剤，ポビドンヨード剤，マルチパーパスソリューション．softcontactlensdisinfectionsolution,proteindeposits,hydrogenperoxide,povidoneiodine,multi-purposesolution.Cはじめにソフトコンタクトレンズ（softcontactlens：SCL）やシリコーンハイドロゲルコンタクトレンズ（siliconeChydrogelCcontactlens：SHCL）は，視力および整容補正，眼表面疾患の治療などを使用目的として普及してきた1,2）．1日交換とC1週間連続装用タイプ以外の頻回交換タイプのCSCLやCSHCLにおいては適切なレンズケアが必要である3）．レンズケアにはCSCL用消毒剤が多く使用されており，有効成分の観点からC3種類に分類される．1種類目は，塩化ポリドロニム，ポリヘキサニド塩酸塩またはアレキシジン塩酸塩を有効成分とするマルチパーパスソリューション（multi-purposeCsolu-tion：MPS）である4）．MPSはその名のとおり，1本で洗浄，すすぎ，保存が可能であるが，洗浄の際にはこすり洗いが必須である．MPSは簡便に使用できるが，一部ユーザーは適切なこすり洗いを実施していないことが報告されている3）．2種類目は，白金ディスクやカタラーゼにより中和が必要な過酸化水素（hydrogenCperoxide：HP）を有効成分とするHP剤で，こすり洗いは推奨である．HP剤は消毒効果が高いことが報告されており，白金ディスクで中和するCHP剤は防腐剤が含まれないことから，眼刺激が軽減されることが報告されている5,6）．一方，HP剤が適切に中和されない場合は眼表面障害の発生が懸念される7）．3種類目は，アスコルビン酸により中和が必要なポビドンヨード（povidoneiodine：PI）を有効成分とするCPI剤で，HP剤と同様にこすり洗いは推奨である8）．PI剤も消毒効果が高いと報告されているが，適切に中和されない場合はヨードアレルギーが懸念される8,9）．このように，SCL用消毒剤は有効成分に起因する長所ならびに短所はあるが，適切なレンズケアを怠った場合，レンズの汚れによる眼不快感，レンズ装用時の見にくさ，乳頭増殖などのアレルギー症状，アカントアメーバ角膜炎などのCCL関連合併症が発症するため，レンズケアの重要性が報告されている3,10.12）．このような背景から，頻回交換タイプのCSCLやCSHCLに付着した蛋白質や脂質などの汚れに対するCSCL用消毒剤によるレンズケア効果について，invitroおよびCexvivoにおいて検討がなされている3,10.12）．しかしながら現時点において，PI剤による頻回交換タイプのCSCLやSHCLに付着した蛋白質のレンズケア効果を検討した報告はない．そこで今回，invitroにおける白金ディスクで中和するタイプのCHP剤に対するCPI剤を含むC4種類のCSCL用消毒剤の蛋白質付着に対するレンズケア効果を比較検討した．CI対象および方法試験CCLにはCSCLの原材料ポリマー分類のグループCIVのCeta.lconAおよびグループCV-1のCSHCLであるCseno.lconAを用いた（表1）．試験CCLをブリスターパックから取り出し，リン酸緩衝液（phosphateCbu.ersaline：PBS）で試験CLを繰返し洗浄後，報告に従って涙液組成を模したCPBS（表2）を含んだプラスチック試験管に試験CCLを移し，37℃でC16時間浸漬して蛋白質を付着させた試験CCLを準備した13）．その後，HP剤，PI剤，MPS-A，MPS-B，MPS-CおよびCPBSを用いて試験CCLのレンズケアを実施した（表3）．検体数の設定根拠は，統計的検出力ではなく，実施可能性に基づき各C6枚に設定した．試験手順に基づくバイアスを最小化するため，レンズケアおよび測定の順序をランダム化し，レンズケア時間は各CSCL用消毒剤の最短消毒時間として，置換ブロック法により事前に作製された割付順序に従って実施した．レンズケア後，1Cw/v％ドデシル硫酸ナトリウム（sodiumCdodecylsulfate：SDS）溶液を用いて試験CCLから蛋白質を抽出し，MicroCBCACproteinCassaykitを用いて分光光度計で波長C562Cnmにおける吸光度を測定した．評価項目は，5種類のCSCL用消毒剤のCHP剤，PI剤，MPS-A，MPS-B，MPS-Cでのレンズケア後および対照としたCPBSでの洗浄後の試験CCLに付着した蛋白量（μg/レンズ）とした．吸光度測定のブランクの標準液は，1％炭酸ナトリウムを含むC1Cw/v％CSDS溶液を使用した．MicroBCAproteinassaykitに付属のアルブミン標準サンプルを用いて検量線を作製し，試験CLのC1枚当たりの蛋白質付着量（アルブミンに換算した総蛋白質量）を算出した．操作のばらつきを最小化するため，表1試験CLの概要試験CCLCeta.lconACseno.lconA構成モノマー2-HEMA，CMAAなど2-HEMA，CSiMAA2，mPDMS1000，CDMAなど酸素透過係数＊C28C103含水率［％］C58C38＊＊ベースカーブ［mm］8.4，C8.78.4，C8.8直径［mm］C14.0C14.0中心厚［mm］（.3.00D）C0.09C0.07SCLの原材料ポリマー分類CIVCV-1＊（cm2/sec）×（mlOC2/ml×mmHg）＊＊本研究のベースカーブはCeta.lconAがC8.7，seno.lconAがC8.8のC.3.00Dを使用．表2人工涙液組成組成含有量［mg/ml］TMS-PBS：Dulbecco’sphosphatebu.eredsaline（D8662［Sigma-Aldrich］）CaCl2C0.1CMgCl2・C6HC2OC0.1CKClC0.2CKH2PO4C0.2CNaClC8.0CNa2HPO4・C7HC2OC2.16CLipidC0Lysozyme（LC6876-10G［Sigma-Aldrich］）C5.3CBovineserumalbuminC3.5TMS：tear-mimickingsolution，PBS：phosphateCbu.eredCsaline.表3本研究で使用した5種類のSCL用消毒剤のレンズケア方法および検体数消毒剤CHPCPICMPS-ACMPS-BCMPS-C洗浄およびすすぎの方法こすり洗いを含めた洗浄およびすすぎ洗いを実施しないこととした．こすり洗いを含めた洗浄およびすすぎ洗いを実施しないこととした．レンズを手のひらにのせ，本剤を数滴つけて，レンズの両面を各々20.C30回指で軽くこすりながら洗うこととした．洗ったレンズの両面を本剤で十分にすすぐこととした．レンズを手のひらにのせ，本剤をC3.C5滴落として片面を人差し指で約C10秒間ていねいに洗浄することとした．裏面も本剤をC3.5滴落として約C10秒間ていねいに洗浄することとした．レンズの両面を本剤ですすぎ，表面の残留物を十分に取り除くこととした．手のひらにレンズをのせ，本剤を数滴つけて，レンズの両面を各々20.C30回指で軽くこすりながら洗うこととした．洗ったレンズの両面を本剤でC5秒以上すすぐこととした．最短消毒時間6時間4時間検体数各C6枚（eta.lconAおよびCseno.lconA）HP：hydrogenperoxide，PI：povidoneiodine，MPS：multi-purposesolution．作業員は操作の途中で交代せずに操作を行うこととした．統計解析は，5種類のCSCL用消毒剤でのレンズケア後およびPBSでの洗浄後の試験CCLに付着している蛋白量（μg/レンズ）について，各群の記述統計量（n，平均値，標準偏差，中央値，最小値，最大値）を算出することとした．一元配置分散分析によりC6群間の群間比較を行うこととした．本研究におけるすべての操作ならびに測定は，住化分析センター株式会社へ委託した．統計処理はCMicrosoftCExcel2016で実施し，記述統計量は正規分布に従っており，対応のないCt検定で実施した．CII結果1.試験CLに付着した蛋白質量試験CCL付着した蛋白質量はCeta.lconAがC1,089.0C±98μg/レンズ，seno.lconAがC7.8C±1.1Cμg/レンズでCeta.lconAが有意に多かった（対応のないCt検定p＜0.05，図1）．C1,400＊1,2001,00080060040020001,089.07.8eta.lconAseno.lconA図1試験CLに付着した蛋白質量各群Cn＝6，平均値C±標準偏差［μg/レンズ］，＊p＜0.0001対応のないCt検定．C1,4001,2001,0008006004002000＊＊2.eta.lconAへの蛋白質付着量Eta.lconAへの蛋白質付着量がCseno.lconAに比べて有意に多かったため，PBS，HP剤，PI剤およびC3種類のMPSでのレンズケア後の蛋白質付着量はCeta.lconAで評価することとした．eta.lconAに付着した蛋白質量は，PBSがC727.5C±160μg/レンズ，HP剤がC528.1C±88Cμg/レンズ，PI剤がC758.1C±155μg/レンズ，MPS-AがC858.5C±218Cμg/レンズ，MPS-BがC730.4C±140Cμg/レンズ，MPS-CがC841.1C±257Cμg/レンズで，レンズケア前のCeta.lconAの蛋白質付着量よりも有意に減少した（対応のないCt検定Cp＜0.05，図2）．また，5種類のCSCL用消毒剤のみでCeta.lconAに付着した蛋白質量を比較すると，HP剤は他の消毒薬に対して有意に低値であった（対応のないCt検定p＜0.05，図2）．CIII考察わが国では過酸化水素のコールド消毒システムとしてのSCL用消毒剤がC1991年に発売14）されて以来，MPS，HP剤およびCPI剤とC32種類が販売15）されており，頻回交換タイプのCSCLおよびCSHCLユーザーが使用している．SCLやSHCLの販売経路は眼科，CL量販店，眼鏡店，インターネットと多岐3）にわたる．一方，適切なレンズケアを指導されていないことによるCCL関連合併症が問題視されており，Cinvitro10,11）およびCexvivo11,12）におけるCSCL用消毒剤のレンズケア効果，消毒効果および眼表面への影響について報告がなされている．本報告はCinvitroでの結果ではあるものの，PI剤を含むC5種類のCSCL用消毒剤による頻回交換タイプのSCLに付着した蛋白質のレンズケア効果を検討した初めての報告である．＊＊＊図2レンズケア前後のeta.lconAに付着した蛋白質量の比較各群Cn＝6，平均値C±標準偏差［μg/レンズ］，＊p＜0.05対応のないCt検定．HP：hydrogenperoxide，PI：povidoneCiodine，MPS：multi-purposesolution，PBS：phosphatebu.ersaline.土至田らは，正の電荷を帯びているリゾチームは負の電荷を帯びているイオン性CSCLに引き付けられるため，SCLの原材料ポリマー分類のグループCIIIおよびCIVのCSCLに蛋白質が付着しやすい傾向であると報告している13）．本研究でも，eta.lconAのほうがCSHCLのCseno.lconAよりもレンズC1枚当たりの蛋白質付着量は有意に多かったことは，eta-.lconA中のカルボキシル基由来の負の電荷と本研究で使用した蛋白質類中の正の電荷との静電気的な相互作用が影響したものと考えた15,16）．Kielは過酸化水素剤の分解時の酸素の発泡力は蛋白質の洗浄効果を示すと報告している17）．Kielらの研究における試験レンズであったCvi.lconAにおいて，酸素バブリングまたは触媒ディスクなしの過酸化水素システム溶液で循環させたレンズよりも，過酸化水素システム溶液および触媒ディスクありで循環させたレンズから有意に多くの蛋白質が除去されたと報告している．HP剤の触媒ディスクありの条件，中和されたCHP剤の酸素バブルおよびCHP剤の触媒ディスクなしの条件での結果を比較した．その結果，試験レンズのCvi.l-conAの洗浄前での蛋白質付着量がC598C±184Cμg/レンズであったのに対して，HP剤の触媒ディスクありがC360C±52Cμg/レンズ，HP剤の酸素バブルがC471C±81Cμg/レンズ，HP剤の触媒ディスクなしがC464C±128Cμg/レンズであった．これらの結果に基づき，HP剤の触媒ディスクありはCHP剤の酸素バブルおよびCHP剤の触媒ディスクなしに比べて有意にCvi.lconAの蛋白質付着量が少なかったと報告している17）．また，RequenaらはCHP剤が蛋白質の構造変化をもたらすと報告している18）．以上から，本研究で使用した試験CCLのCeta.lconAに付着した蛋白質のCHP剤によるレンズケア効果は，HP剤の中和時における発泡力および蛋白質構造変化に起因するものと考えた17,19）．岡田らは，実臨床のCCL装用眼におけるCSCLへの蛋白質の付着量は，invitroにおけるCSCLへの蛋白質付着量と異なり，その可能性としてCCL装用の場合は涙液中のリゾチーム以外の種々の蛋白質，脂質および無機物の相互作用による影響が考えられると報告している20）．土至田らは，CL装用者の眼の状態，涙液中の蛋白質や脂質の種類やそれらの濃度，CL装用状況，生活環境要因や化粧品使用状況なども関与するため，invitroの結果がCinvivoにおけるCCL装用中の状況と同等の結果が得られるか否かの判断はむずかしいものの，研究の傾向を認識するという観点で有意義であったと報告している13）．本研究もCinvitroにおける評価のため，exCvivoにおける頻回交換タイプのCSCLやCSHCLに付着した蛋白質量を正確に反映しているか否かは本研究結果のみでは判断できないが，こすり洗いが推奨であるCHP剤およびCPI剤，こすり洗いが必須であるCMPSのC3種類での試験CCLに付着した蛋白質の洗浄性能を理解するためには，有意義な結果であると考えた．本研究の結果から，頻回交換タイプのレンズ素材中に負の電荷を有するCSCLに付着した蛋白質起因の眼アレルギー症状や眼不快感を軽減するためには，HP剤はCPI剤および本研究で使用したC3種類のCMPSに比べて有用なSCL用消毒剤と考えられた．一方，今後の研究では，こすり洗いを実施した後でCSCL用消毒剤によるレンズケア効果や，CL装用後の頻回交換タイプのCSCLやCSHCLに付着した蛋白質のレンズケア効果の検討が必要と考えた．本研究でCeta.lconAに付着した蛋白質に対するC5種類のSCL用消毒剤のレンズケア効果が認められた．HP剤はCPI剤ならびに本研究で使用したC3種類のCMPSに比べて，レンズ素材中に負の電荷を有するCSCLのCeta.lconAに付着した蛋白質に対するレンズケア効果が優れていることが示された．利益相反：本研究は日本アルコン株式会社による研究資金にて実施した．文献1）日本コンタクトレンズ学会コンタクトレンズ診療ガイドライン編集委員会：コンタクトレンズ診療ガイドライン（第C2版）．日眼会誌118：557-591,C20142）奥野賢亮，井上智之，堀裕一ほか：眼表面疾患に対するシリコーンハイドロゲルレンズの治療的使用に関する検討．臨眼64：1533-1538,C20103）宇野敏彦，福田昌彦，大橋裕一ほか：重症コンタクトレンズ関連角膜症全国調査．日眼会誌115：107-115,C20114）WaltherCH,CSubbaramanCLN,CJonesL：E.cacyCofCcontactClensCcareCsolutionsCinCremovingCcholesterolCdepositsCfromCsiliconeChydrogelCcontactClenses.CEyeCContactCLensC45：C105-111,C20195）LievensCW,KannarrS,ZootaLetal：LidpapillaeimproveC-mentCwithhydrogenperoxidelenscaresolutionuse.OptomVisSciC93：933-942,C20166）WaltersCR,CMcAnallyCC,CGabrielCMCetal：ComparisonCofCtheCantimicrobialCe.cacyCofChydrogenCperoxideCandCpovi-doneiodidecontactlenscareproducts.AAOptC20197）福田正道，北川和子，佐々木一之：ソフトコンタクトレンズ用消毒剤の細胞毒性の検討．日コレ誌C32：39-42,C19908）Martin-NavarroCM,Lorenzo-MoralesJ,Lopez-ArencibiaAetal：Acanthamoebaspp.：E.cacyofBioclenFROneStepR,apovidone-iodinebasedsystemforthedisinfectionofcontactlenses.ExpParasitolC126：109-112,C20109）植田喜一：CLフィッティングケースバイケースポビドンヨードアレルギーが認められたケース．日コレ誌C47：C293-294,C200510）PuckerAD,NicholsJJ：Impactofarinsesteponproteinremovalfromsiliconehydrogelcontactlenses.OptomVisSciC86：943-947,C200911）OmaliCNG,CSubbaramanCLN,CColes-BrennanCCCetal：Bio-logicalCandCclinicalCimplicationsCofClysozymeCdepositionConCsoftcontactlenses.OptomVisSciC92：750-757,C201512）NegarCBO,CHeynenCM,CSubbaramanCLNCetal：ImpactCofClensCcareCsolutionsConCproteinCdepositionConCsoftCcontactClenses.OptomVisSciC93：963-972,C201613）土至田宏，村上晶，下川幸恵：シリコーンハイドロゲルレンズのタンパク質および脂質に対する付着性の評価．日コレ誌54：111-115,C201214）小玉裕司：ケア用品の基礎知識．日コレ誌C42：S11-S16,C200015）小玉裕司，梶田雅義，植田喜一ほか：コンタクトレンズデータブック第C3版．メジカルビュー社，201416）TakahashiCD,CUchidaCK,CIzumiT：ActivitiesCofClysozymeCcomplexedwithpolysaccharideandpotassiumpoly（vinylalcoholsulfate）withvariousdegreesofesteri.cation.PolymBullC67：741-751,C201117）KielJS：Proteinremovalfromsoftcontactlensusingdis-infection/neutralizationCwithChydrogenCperoxide/catalyticCdisc.ClinTherC15：30-35,C199318）RequenaCJR,CDimitroyaCMN,CLegnameCGCetal：OxidationCofCmethionineCresiduesCinCtheCprionCproteinCbyChydrogenCperoxide.ArchBiochemBiophysC432：188-195,C200419）三村達哉，須永鷹博，溝田淳：過酸化水素水によるCCL付着花粉の洗浄効果．アレルギーの臨床C40：60-69,C202020）岡田栄一，松田智子，横山哲朗ほか：ソフトコンタクトレンズに付着する涙液中タンパク質成分の解析．日コレ誌C49：C238-242,C2007C＊＊＊

———————————————————————-Page1（97）15670910-1810/08/\100/頁/JCLSあたらしい眼科25（11）：15671572，2008cはじめに最近，ソフトコンタクトレンズ（SCL）ユーザーでの細菌性角膜炎の発症が問題になっており1），マルチパーパスソリューション（MPS）の使用との関連性が議論されている2）．細菌性角膜炎の原因としては，MPSの不十分な殺菌効力3）やユーザーのコンプライアンスの低さ4）などが想定されるが，MPSの細胞毒性が角膜上皮細胞に及ぼす影響も考慮に入れる必要がある．柳井ら5）は14種類の市販MPSを比較し，主成分が同じポリヘキサメチルビグアニド（PHMB）であっても，添加剤の種類によって細胞毒性や殺菌効力が大きく異なることを報告した．一方，角膜上皮細胞は外傷を受けるなどのストレス状態にさらされると炎症性細胞を誘導するためにサイトカインを分泌することが知られている6）．毒性の強いMPSの使用は角膜にストレスを与えると考えられる〔別刷請求先〕今安正樹：〒487-0032愛知県春日井市高森台5-1-10（株）メニコン総合研究所Reprintrequests：MasakiImayasu,Ph.D.,CentralR&DLab.,MeniconCo.,Ltd.,5-1-10Takamoridai,Kasugai-shi,Aichi-ken487-0032,JAPAN培養角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現に対するマルチパーパスソリューションの影響今安正樹＊1,3白石敦＊2大橋裕一＊2島田昌一＊3＊1（株）メニコン総合研究所＊2愛媛大学医学部眼科学教室＊3名古屋市立大学医学部第2解剖学講座EectsofMultipurposeSolutionsonCytokineGeneExpressionofCornealEpithelialCellsMasakiImayasu1,3）,AtsushiShiraishi2）,YuichiOhashi2）andShoichiShimada3）1）CentralR&DLab.,MeniconCo.,Ltd.,2）DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine,EhimeUniversity,3）DepartmentofAnatomy,NagoyaCityUniversityMedicalSchool目的：コンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション（MPS）の角膜への影響を明確にするため，角膜上皮細胞を市販MPSまたは配合成分で処理したときのサイトカイン遺伝子発現量および産生量を解析する．方法：培養ヒト角膜上皮細胞を用い，7種のMPSまたは配合成分を添加した培養液で3，6，24時間培養した．RNAを抽出し，サイトカイン遺伝子〔インターロイキン（IL）-8，トランスフォーミング増殖因子（TGF）-b2，IL-18，IL-1b，IL-6〕発現量をreal-timepolymerasechainreaction（PCR）法で，培養上清中のサイトカイン産生量を抗体アレイで定量した．結果：ホウ酸を含むMPSではIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-6の発現量が36時間後に増加し，その後減少した．これらのMPSでは24時間後のIL-8産生量も増加した．配合成分のなかでは，ホウ酸のみがサイトカイン遺伝子発現量を増加させた．結論：MPSの配合成分であるホウ酸が炎症性サイトカインの産生に関与している可能性が示された．Inordertoclarifytheeectsofmultipurposesolutions（MPS）onthecornea,weanalyzedthecytokinegeneexpressionandproteinlevelofcornealepithelialcellstreatedwithMPSoringredients.Humancornealepithelialcellswereculturedfor3,6or24hoursinmediumcontainingcommerciallyavailableMPSoringredients.AfterRNAextraction,geneexpressionsofinterleukin（IL）-8,transforminggrowthfactor（TGF）-b2,IL-18,IL-1bandIL-6wereanalyzedbyreal-timepolymerasechainreaction（PCR）.Proteinlevelsweredeterminedbyantibodyarray.MPScontainingboricacidcausedup-regulationofIL-8,TGF-b2,IL-18andIL-6after3and6hours,whichthendecreasedat24hours.TheMPSalsopromotedIL-8productionduring24hour-incubation.Oftheingredientstested,onlyboricacidhadsignicanteectsongeneandproteinexpressionsofinammatorycyto-kines.Theseresultsdemonstratethatboricacidmayhavesignicanteectoninammatorycytokineproductionincornealepithelialcells.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）25（11）：15671572,2008〕Keywords：角膜上皮細胞，サイトカイン，マルチパーパスソリューション，コンタクトレンズ．cornealepithelialcells,cytokine,multipurposesolution,contactlens.———————————————————————-Page21568あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（98）ため，サイトカイン遺伝子の発現量が増加する可能性が想定される．角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現を解析することにより，角膜へのストレスを高感度で定量的に評価できる方法が構築できると思われる．そこで本論文では，ヒト角膜上皮細胞を，種々のMPS製品または配合成分を添加した培養液で培養し，MPSまたは配合成分を添加しない培養液で培養した場合とのサイトカイン遺伝子の発現量の差をreal-timepolymerasechainreac-tion（PCR）法により定量的に解析した．また，蛋白質レベルでの評価のため，培養液中のサイトカイン産生量を抗体アレイで定量した．I実験材料および方法1.実験材料実験に使用したMPSとおもな配合成分を表1に示す．MPS-AからMPS-Gまでの7種類の市販MPSを用いた．主成分の殺菌剤にはPHMB，AlexidineまたはPolyquadが使用されている．このなかでMPS-AとMPS-B以外は緩衝剤としてホウ酸を含む．配合成分単独での実験に使用した成分名，濃度などを表2に示す．MPSに一般的に使用されている界面活性剤，殺菌剤，緩衝剤を実際の配合濃度に近い濃度で使用した．2.実験方法a.培養細胞の準備培養細胞として，SV40ウイルス感染により不死化したヒト角膜上皮細胞（以下，HCET細胞）7）を理化学研究所細胞バンクより購入して使用した．HCET細胞を6cm組織培養用ディシュにコンフルエントになるまで培養した．培養液はDMEM/F12（GIBCO）＋5％ウシ胎仔血清（FBS）（GIBCO）を用いた．血清無添加の培養液に各種MPSまたは配合成分を10％添加した試験液を準備し，組織培養用ディシュに4ml添加して37℃，5％CO2で3，6，24時間培養した．b.培養細胞からのRNAの抽出および定量組織培養用ディシュの培養液を捨て，冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後，1mlのTRIZOLR試薬（invitrogen）を添加した（氷冷下）．セルスクレーパーを用いてディシュ表面に付着している細胞を離させた（氷冷下）．20ゲージの注射針を取り付けた2.5mlのシリンジで，TRIZOLR試薬の吸引を20回程度くり返した後，1.5mlのマイクロチューブに回収した．以下，TRIZOLR試薬の取扱説明書に従ってtotalRNAを精製し，30μlのDEPC（diethylpyrocarbonate）処理水に溶解させた．c.逆転写反応およびrealtimereversetranscription（RT）PCRパーソナルスペクトルモニター（AmershamBiosciences，GeneQuantpro）で260nmの吸光度を測定することによりRNA濃度を定量し，サンプル濃度を800ng/μlに調整した．PrimeScriptTMRTreagentsKit（TaKaRa）の取扱説明書に従い，50μlの反応系にてcDNAに変換した．つぎに，SYBRRPremixExTaqTM（TaKaRa）の取扱説明書に従い，25μlの反応系にてreal-timePCRを行った（TaKaRa，表2実験に使用したMPS配合成分配合成分種類濃度製造元HCO界面活性剤1.0％日光ケミカルズTetronic1107界面活性剤1.0％BASFJapanPoloxamer407界面活性剤1.0％BASFJapanAlexidine殺菌剤1ppmTrontoResearchPHMB殺菌剤1ppmアーチケミカルズホウ酸（Boricacid）緩衝剤0.5％日興製薬1.0％表1実験に使用した市販MPSMPS殺菌剤界面活性剤ホウ酸の有無MPS-APHMB＊HCO＊＊MPS-BPHMBPoloxamerMPS-CPHMBTetronic＋MPS-DAlexidinePoloxamer/Tetronic＋MPS-EPolyquadTetronic＋MPS-FPolyquadTetronic＋MPS-GPHMB不明＋＊PHMB：polyhexamethylbiguanid.＊＊HCO：PEGhydrogenatedcastoroil.表3RealtimeRTPCRに使用したプライマーペアの塩基配列ヒト遺伝子F/Rプライマー塩基配列b-actinFATTGCCGACAGGATGCAGARGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAIL-8FAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAAACRATCAGGAAGGCTGCCAAGAGTGF-b2FGGATGCGGCCTATTGCTTTARCATTTCCACCCTAGATCCCTCTTIL-18FGCCACCTGCTGCAGTCTACARATCTGGAAGGTCTGAGGTTCCTTIL-1bFCCTCTGGATGGCGGCARTGCCTGAAGCCCTTGCTGIL-6FAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAARGTCAGCAGGCTGGCATTTGTFはセンス，Rはアンチセンスを示す．———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25，No.11，20081569（99）TP800）．サイトカインとしてIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-1b，IL-6の5種類の遺伝子の発現量を解析した．ハウスキーピング遺伝子としては，角膜上皮細胞での発現量が安定なb-actinを選択し（予備実験で確認），b-actin発現量に対する各遺伝子の相対発現量を求めた．さらに，各遺伝子について，MPS（または配合成分）処理群に対するPBS（＋）処理群の相対発現量の比を求め，これを指標とした．なお，各サイトカイン遺伝子およびb-actinのreal-timePCR用プライマーはNCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）の遺伝子データベースよりmRNAの塩基配列を検索し，PrimerExpress（AppliedBio）でプライマーペア候補を検索し，イントロンをはさんだ配列を選択して，SigmaGenosys社に合成を依頼した．プライマーペアの塩基配列を表3に示す．なお，実験は独立して3回くり返し，平均値と標準偏差を求めた．d.抗体アレイによる培養上清のサイトカイン産生量の定量24時間培養した細胞については培養液を回収し，そのままサイトカイン産生量定量に供試した．アレイ基板としてBS-X1324（住友ベークライト）を使用し，抗ヒトIL-8マウスモノクローナル抗体（BIOSORCE），抗ヒトIL-6マウスモノクローナル抗体（ENDOGEN），抗ヒトTGF-b2マウスモノクローナル抗体（RDS）のプロットを住友ベークライトに依頼した．抗体アレイチャンバー（GenTel，12well）に抗体アレイを固定し，培養液を50μl添加して室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，3種類のサイトカインに対するビオチン化抗体混合液〔抗ヒトIL-8ビオチン化抗体（BIO-SOURCE），抗ヒトIL-6ビオチン化抗体（ENDOGEN），抗ヒトTGF-b2ビオチン化抗体（RDS）〕を調整し，50μl添加して室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，Cy5標識ストレプトアビジン（JacksonImmunoResearch）50μlを添加し，室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，乾燥させ，アレイスキャナー（GSILuminocs，ScanArray5000）でCy5蛍光画像を取得した．各プロットの蛍光強度をアレイ用画像処理ソフト（ScanAlyze）で数値化した．各サイトカインの標準液としてヒトIL-8（Acris），ヒトIL-6（Acris），ヒトTGF-b2（Acris）を5，10，20，40，80pg/mlに調整して用いた．なお，実験は独立して3回くり返し，平均値と標準偏差を求めた．II結果a.サイトカイン遺伝子発現に対するMPSの影響MPSで3，6および24時間処理したときの対照〔PBS（＋）〕に対するサイトカイン遺伝子発現比を図1a，bおよびcに示す．MPS処理3時間後ではMPS-CGでIL-8が35.030.025.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1aMPSで3時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．25.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1cMPSで24時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．45.040.035.030.025.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1bMPSで6時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．———————————————————————-Page41570あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（100）約1025倍に増加した．TGF-b2およびIL-6も増加した．一方，MPS処理6時間後においても，MPS-CGではIL-8が高いレベルを維持したが，特にMPS-EGが約20倍高い発現量を示した．MPS-EおよびMPS-FではIL-6が約2030倍に増加した．MPS処理24時間後においては，全体的にサイトカイン発現比はかなり回復し，特にMPS-Cではほぼ正常レベルになった．MPS-DGではIL-8は回復したが，IL-18とIL-6が約510倍高いレベルを維持していた．すべての処理時間において，MPS-AおよびBではすべてのサイトカイン遺伝子に関し，発現量の増加は認められなかった．すべてのMPS処理において，IL-1bの発現量増加は認められず，IL-8の発現量増加をもたらしたMPS-CGではむしろ発現量が減少する傾向を示した．b.サイトカイン産生量に対するMPSの影響培養24時間で産生されたサイトカイン（IL-8，TGF-b2およびIL-6）を抗体アレイで定量した結果を図2に示す．対照のPBS（＋）でのサイトカイン産生量はIL-8が0.5±0.2pg/ml，TGF-b2が4.3±1.3pg/ml，IL-6が0.3±0.2pg/mlであった．対照と比較してMPS-Aではサイトカイン産生量の増加は認められなかったが，MPS-BおよびCではTGF-b2の増加が認められた．MPS-D，EおよびGでは3種のサイトカインすべてが増加した．MPS-FではIL-8が増加した．全体的にサイトカイン産生量が最も大きく増加したのはMPS-Eであった．c.サイトカイン遺伝子発現に対する配合成分の影響図1で示されたMPSによるサイトカイン遺伝子発現量の増加がMPSのどの配合成分によるかを明確にするため，配合成分単独での遺伝子発現に対する影響を検討した．配合成分処理3時間および24時間後の結果を図3aおよび3bに示す．3時間処理では，配合成分のなかでホウ酸のみがIL-8，TGF-b2，IL-6発現量を増加させ，1％濃度ではそれぞれ約45倍，5倍，15倍となった．24時間後では1％ホウ酸の効果は3時間と比較してかなり回復したが，IL-8およびIL-6はまだ高いレベルを維持しており，IL-18発現量への影響もみられた．1％HCOは0.5％ホウ酸と同程度の効果を示した．d.サイトカイン産生量に対する配合成分の影響配合成分単独で24時間作用させたときのサイトカイン産生量への影響を検討した結果を図4に示す．界面活性剤60.050.040.030.020.010.00.0：IL-8：TGF-b2：IL-6pg/m?MPS-APBS（＋）MPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-G図2MPSで24時間処理したHCET細胞のサイトカイン産生量b2：IL-18：IL-1b：IL-6図3a配合成分で3時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．20.015.010.05.00.0Expressionratio1％HCO1％Tetronic1％Poloxamer1ppmAlexidine1ppmPHMB0.5％Boricacid1.0％Boricacid：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図3b配合成分で24時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.25，No.11，20081571（101）（HCO，TetronicおよびPoloxamer）および殺菌剤（Alexi-dineおよびPHMB）はTGF-b2産生量を有意に増加させた．ホウ酸は濃度依存的にIL-8産生量を増加させ，1％濃度では約70pg/mlにも達した．TGF-b2産生量への影響も認められた．III考按今回，ヒト角膜上皮細胞へのMPS投与で変化する可能性のあるサイトカイン遺伝子としてIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-1b，IL-6を採択した．予備実験においてはその他のサイトカインとしてIL-1a，IFN-g，TNF-aなども検討したが，変化が少なかったため対象から除外した．MPSの影響としては，3時間後にIL-8が，6時間後にIL-8に加えてIL-6が，24時間後にはIL-6とTGF-b2の発現量増加が目立った．IL-8およびIL-6が増加したMPSでは，IL-1bの発現量が減少していた．Xueら8）が報告しているように，IL-1はIL-6やIL-8などの炎症性サイトカインの産生を促進する急性的サイトカインであるため，IL-6・IL-8の増加によるフィードバック制御によって，経時的に発現量が下がったと考えられる．TGF-b2は角膜上皮細胞の増殖，遊走，分化，接着制御など多くの生理作用をもつサイトカインであり，角膜上皮創傷治癒過程において発現量が増加することが知られている9）．また，IL-18はマウス角膜に緑膿菌を感染させたときに，24時間後以降に発現量が増加することが知られている10）．今回の実験においては，TGF-b2とIL-18は624時間と長時間作用させた場合に発現量が増加しており，外傷や細菌感染などの重篤な障害で初めて発現するサイトカインと考えられる．7種類のMPSを比較すると，MPS-AおよびMPS-Bではサイトカイン遺伝子の変化が認められなかったが，MPS-C，MPS-D，MPS-E，MPS-FおよびMPS-GではIL-8，TGF-b2，IL-6において顕著な発現量増加を示した．前2者のMPSがホウ酸を含まないのに対し，後5者がホウ酸を含むことより，ホウ酸がサイトカイン遺伝子発現に関与した可能性が考えられる．そこで，代表的なMPS配合成分7種類を選択してサイトカインへの影響を検討したところ，ホウ酸のみが顕著な影響を示し，IL-8，IL-6遺伝子発現量を増加させた．また，抗体アレイによるサイトカイン産生量の測定実験においても，ホウ酸を含むMPSおよび0.51.0％のホウ酸が24時間後のサイトカイン産生量を増加させることを確認した．ホウ酸が実使用濃度よりも低い0.1％で細胞毒性を有することは，Santodomingoら11）のV79細胞を用いたコロニー形成阻害試験により報告されている．今回の実験ではサイトカイン遺伝子発現および産生量の増加として細胞毒性が検出されたと考えられる．一方，筆者らは角膜上皮細胞のタイトジャンクション（特にZO-1）に対するMPSの影響を細胞生物学的および電気生理学的手法で検討し，配合成分にホウ酸を含むMPSのみがタイトジャンクションの構造を破壊することを報告している12）．サイトカイン遺伝子発現の増加がタイトジャンクションの構造破壊をひき起こすメカニズムの詳細は不明であるが，IL-1やIL-8などの炎症性サイトカインはストレス応答性のMAPK（mitogen-activatedproteinkinase）の活性化をひき起こすことが知られており，MAPKカスケードなどの細胞内シグナル伝達系の活性化を通してタイトジャンクションが破壊されたと考えられる13）．角膜上皮最表層細胞のタイトジャンクションは角膜のバリア機能においてきわめて重要な役割を担っているため，その構造破壊は緑膿菌などの病原菌の角膜への侵入を容易にし，細菌性角膜炎感染のリスクを増大させると考えられる1）．すなわち，コンタクトレンズ装用とケア用品（特にMPS）使用による細菌性角膜炎発症のリスクをなるべく低くするには，角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現への影響の少ないMPSを選択し，角膜バリア機能をなるべく健全に保つことが重要と考えられる．文献1）大橋裕一，鈴木崇，原祐子ほか：コンタクトレンズ関連細菌性角膜炎の発症メカニズム．日コレ誌48：60-67,20062）InoueN,ToshidaH,MamadaNetal：Contactlens-inducedkeratitisinJapan.EyeContactLens33：65-69,20073）LevyB,HeilerD,NortonS：ReportontestingfromaninvestigationofFusariumkeratitisincontactlenswear-90.080.070.060.050.040.030.020.010.00.0：IL-8：TGF-b2：IL-6pg/m?1％HCOPBS（＋）1％Tetronic1％Poloxamer1ppmAlexidine1ppmPHMB0.5％Boricacid1.0％Boricacid図4配合成分で24時間処理したHCET細胞のサイトカイン産生量———————————————————————-Page61572あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（102）ers,EyeContactLens32：256-261,20064）星合竜太郎，濱田いずみ：レンズケアに対するコンタクトレンズ使用者の意識．日コレ誌49：119-123,20075）柳井亮二，植田喜一，西田輝夫ほか：市販多目的剤の消毒効果と細胞毒性の比較．日コレ誌49（補遺）：S13-S18,20076）外園千恵，今西二郎：サイトカイン．眼科NewInsight5（木下茂編），p154-165,メジカルビュー社，19957）Araki-SasakiK,OhashiY,SasabeTetal：AnSV40-immortalizedhumancornealepithelialcelllineanditscharacterization.InvestOphthalmolVisSci36：614-621,19958）XueML,ZhuH,WillcoxMDP：TheroleofIL-1betaintheregulationofIL-8andIL-6inhumancornealepitheli-alcellsduringPseudomonasaeruginosacolonization.CurrEyeRes23：406-414,20019）山下英俊：トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-b）スーパーファミリーの眼組織における作用．日眼会誌101：927-947,199710）HuangX,McClellanSA,BarrettRPetal：IL-18contrib-utestohostresistanceagainstinfectionwithPseudomo-nasaeruginosathroughinductionofIFN-gammaproduc-tion.JImmunol168：5756-5763,200211）Santodomingo-RubidoJ,MoriO,KawaminamiS：Cyto-toxicityandantimicrobialactivityofsixmultipurposesoftcontactlensdisinfectingsolutions.OphthalPhysiolOpt26：476-482,200612）ImayasuM,ShiraishiA,OhashiYetal：Eectsofmulti-purposesolutionsoncornealepithelialtightjunctions.EyeContactLens34：50-55,200813）WangY,ZhangJ,YiXetal：ActivationofERK1/2MAPkinasepathwayinducestightjunctiondisruptioninhumancornealepithelialcells.ExpEyeRes78：125-136,2004＊＊＊