《原著》あたらしい眼科31（1）：105.109，2014c眼窩外涙腺摘出ラット・ドライアイモデルに対するジクアホソルナトリウム点眼液とレバミピド点眼液の効果堀裕一柴友明前野貴俊東邦大学医療センター佐倉病院眼科ComparisonofEfficacybetweenDiquafosolOphthalmicSolutionsandRebamipideOphthalmicSuspensionsinTreatmentofRatDryEyeModelYuichiHori,TomoakiShibaandTakatoshiMaenoDepartmentofOphthalmology,TohoUniversitySakuraMedicalCenterラットドライアイモデルに対する3％ジクアホソルナトリウム点眼液と2％レバミピド点眼液の効果について比較検討した．涙液減少型ドライアイモデルとして眼窩外涙腺を摘出し8週以上経過したラットを用いた．3％ジクアホソルナトリウム点眼液，2％レバミピド点眼液，防腐剤無添加人工涙液をそれぞれ4週間点眼し，角膜上皮障害をフルオレセイン染色スコアにて評価した．また，各点眼液を単回点眼し，10分後の涙液量を測定した．さらに，4週間点眼後に眼瞼結膜を採取し，過ヨウ素酸シッフ（PAS）陽性細胞率を算出した．その結果，3％ジクアホソルナトリウム点眼液群では人工涙液群と比べ有意に角膜上皮障害の改善，涙液量およびPAS陽性細胞率の増加を認めた（p＜0.05,Tukey’stest）が，2％レバミピド点眼液群では有意差は認められなかった（p＞0.05,Tukey’stest）．また，点眼2週後のフルオレセイン染色スコアにおいて3％ジクアホソルナトリウム点眼群は2％レバミピド群に比して有意に低値を示した（p＜0.05,Tukey’stest）．以上より，涙液減少型ドライアイモデルにおいて3％ジクアホソルナトリウム点眼液は2％レバミピド点眼液に比べて改善効果を示した．Wecomparedtheeffectsof3％diquafosolophthalmicsolutionsand2％rebamipideophthalmicsuspensionsintreatingaratdryeyemodel.Ratexorbitallacrimalglandswereremovedsurgicallytodevelopthedryeyemodel.Diquafosolophthalmicsolutions（6timesdaily）,rebamipideophthalmicsuspensions（4timesdaily）andunpreservedartificialtears（6timesdaily）wereadministeredfor4weeks.Weperformedfluoresceincornealstaining（FCS）andperiodicacid-Schiff（PAS）stainingofthepalpebralconjunctivatodeterminechangesinFCSscoreandPAS-positivecellratiointheratdryeyemodelafter2and4weeksoftreatment,respectively.TheFCSscoredecreasedsignificantly（p＜0.05,Tukey’smultiplecomparison）withthediquafosolophthalmicsolutions,ascomparedwiththeunpreservedartificialtearsafter2and4weeksoftreatmentandwiththerebamipideophthalmicsuspensionsafter2weeksoftreatment.ThePAS-positiveratiointhepalpebralconjunctivaincreasedsignificantlyafter4weeksoftreatmentwithdiquafosolophthalmicsolutions（p＜0.01,Tukey’smultiplecomparison）,ascomparedwiththerebamipideophthalmicsuspensions.Theseresultsindicatethatintear-deficiencytypedryeye,diquafosolophthalmicsolutionsaremoreeffectivethanrebamipideophthalmicsuspensions.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（1）：105.109,2014〕Keywords：ドライアイ，ジクアホソルナトリウム点眼液，レバミピド点眼液，ラットドライアイモデル．dryeye,diquafosolophthalmicsolutions,rebamipideophthalmicsuspensions,ratdryeyemodel.はじめにり，眼不快感や視機能異常を伴う」と定義しており，ドライわが国では2006年にドライアイ研究会が「ドライアイとアイは，多因子による疾患であることが認識されている1）．は，様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であドライアイは大きく涙液減少型ドライアイと蒸発亢進型ドラ〔別刷請求先〕堀裕一：〒285-8741佐倉市下志津564-1東邦大学医療センター佐倉病院眼科Reprintrequests：YuichiHori,M.D.,DepartmentofOphthalmology,TohoUniversitySakuraMedicalCenter,564-1Shimoshizu,Sakura,Chiba285-8741,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（105）105 イアイに分けられるが，涙液減少型ドライアイはSjogren症候群と非Sjogren症候群に分類され，蒸発亢進型ドライアイは，内因性と外因性に分けられ，内因性はマイボーム腺機能不全，瞬目率の低下などが含まれ，外因性ではビタミンA欠乏症，防腐剤，コンタクトレンズ装用などが含まれる2）．このように原因も症状もさまざまなドライアイに対して，従来の点眼治療の大半は精製ヒアルロン酸点眼液が使用されていた．しかし，ドライアイ治療薬として2010年12月に3％ジクアホソルナトリウム点眼液（ジクアスR点眼液3％，以下ジクアス），2012年1月に2％レバミピド点眼液（ムコスタR点眼液UD2％，以下ムコスタ）が上市され，これらの新しいドライアイ治療用点眼液の登場により，治療選択幅が広がった．最近ではドライアイ治療の新しい考えとして，眼表面を層別に治療する考え方（tearfilmorientedtherapy：TFOT）も浸透しつつある3）．ジクアスはP2Y2受容体作動薬であり，涙液分泌促進作用4），ムチン分泌促進作用5,6）および膜型ムチン遺伝子（MUC1，MUC4およびMUC16）発現促進作用7）を有することが報告されている．一方，ムコスタは，杯細胞増殖作用8），ムチン様糖蛋白質産生促進作用および膜型ムチン遺伝子（MUC1およびMUC4）発現促進作用9）を有することが報告されている．今後この2剤をどのようなドライアイに対して使い分けていくかが今後の検討課題となっている．本研究では，ジクアスとムコスタの薬理学的特性を明らかにするために，眼窩外涙腺摘出ラットのドライアイモデルの角膜上皮障害，杯細胞数および涙液量に対する両剤の効果を比較検討した．I実験方法1.点眼液防腐剤無添加人工涙液（ソフトサンティアR，参天製薬，以下ソフトサンティア），3％ジクアホソルナトリウム点眼液（ジクアスR点眼液3％，参天製薬，以下ジクアス）および2％レバミピド点眼液（ムコスタR点眼液UD2％，大塚製薬，以下ムコスタ）を用いた．2.実験動物ラット（雄性SD）は日本エスエルシーより購入し，1週間馴化飼育した．本研究は，「動物の愛護及び管理に関する法律（昭和48年10月1日，法律第105号）」および「実験動物に飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準（平成18年4月28日，環境省告示第88号）」を遵守し，実施した．3.ドライアイモデル作製および点眼Fujiharaらの方法10）に従って，眼窩外涙腺を各ラットの片眼において摘出した．対照として，眼窩外涙腺摘出を実施しない正常ラット（8眼）を設定した．涙腺摘出から8週間以上経過後，ソフトサンティア，ジクアスおよびムコスタの106あたらしい眼科Vol.31，No.1，2014点眼を開始した．角膜上皮障害の評価および過ヨウ素酸シッフ（PAS）陽性細胞数の評価では，各点眼液の臨床上の用法用量に従い，ソフトサンティアおよびジクアスは1日6回，ムコスタは1日4回で，いずれも1回5μl，4週間点眼した（各8眼）．また，涙液貯留量の評価では，各点眼液を単回点眼した（各12眼）．4.角膜上皮障害の評価各点眼液の点眼前，点眼2および4週後に村上らの方法11）に従って，各眼のフルオレセイン染色スコア（0.9点）により評価した．5.涙液貯留量の評価ラットをペントバルビタール（ソムノペンチル，共立製薬）の腹腔内投与で全身麻酔後，各点眼液を各眼に各5μl点眼した．点眼10分後に，Schirmer試験紙（シルメル試験紙，昭和薬品化工）を1×17mmに裁断したSchirmer試験紙の先端をラットの下眼瞼の結膜.に挿入した．挿入1分後に試験紙を抜き取り，ただちに濡れた部分の長さを0.5mm単位で読み取り，涙液量の評価を行った．6.PAS染色によるPAS陽性細胞率の評価各点眼液を4週間点眼後，ペントバルビタールの腹腔内投与をし，全身麻酔を施した．腹部大動脈切断による放血殺にて安楽死させたのち，眼瞼結膜を採取し，4％パラホルムアルデヒド固定液に浸漬した．ヘマトキシリン・エオジン（HE）およびPAS染色を行い，PAS陽性細胞率を算出した．7.統計解析生物実験データ統計解析システムEXSUS（シーエーシー）を用いて5％を有意水準として解析した．試験系成立の解析ではStudentのt検定（等分散），薬剤比較の解析ではTukeyの多重比較検定を行った．II結果1.角膜上皮障害の検討図1に，眼窩外涙腺摘出ラット・ドライアイモデルに対してソフトサンティア，ジクアスあるいはムコスタを点眼した際の点眼前，点眼2週後および点眼4週後の角膜のフルオレセイン染色スコアの結果を示す．点眼前のフルオレセイン染色スコアは，正常ラットに比して有意に高値を示した（p＜0.01，Studentのt検定）．ソフトサンティア群では，点眼2週後，4週後においてフルオレセイン染色スコアは有意に高値のままであった（p＜0.01，Studentのt検定）．ジクアスを点眼した群では，点眼2週後および4週後においてソフトサンティア群に比してフルオレセイン染色スコアは有意に低値を示した（2週後：p＜0.01，4週後：p＜0.05，Tukeyの多重比較検定）．一方，ムコスタ群では，点眼2週後および4週後においてソフトサンティア群に比べて有意な変化は認められなかった（2週後：p＝0.68，4週後：p＝0.20，Tukey（106） 200μm200μmの多重比較検定）．また，ジクアス群とムコスタ群を比べたティア，ジクアスあるいはムコスタを単回点眼し，10分後ところ，点眼2週後においてジクアス群はムコスタ群に比しの涙液量を比較したところ，ジクアス群では顕著な涙液量のて有意に低値を示した（p＜0.05，Tukeyの多重比較検定）．増加が認められ，無点眼群，ソフトサンティア群およびムコ2.涙液貯留量の比較図2に示すとおり，眼窩外涙腺を摘出すると涙液量は半分86点眼10分後＃＃＄＄＊＊¶¶■：涙腺摘出・無点眼■：涙腺摘出・以下に減少した（p＜0.01，Studentのt検定）．ソフトサン7：正常・無点眼角膜上皮フルオレセイン染色スコア：正常・無点眼■：涙腺摘出・ソフトサンティア＊＊＊＊＊＊＃＃＃†■：涙腺摘出・ジクアス■：涙腺摘出・ムコスタ7涙液量（mm）5ソフトサンティア■：涙腺摘出・ジクアス46■：涙腺摘出・ムコスタ3543212010点眼前点眼2週後点眼4週後図2眼窩外涙腺摘出ラット・ドライアイモデルの涙液量減少に対するジクアスとムコスタの効果200μm200μm正常・無点眼涙腺摘出・無点眼図1眼窩外涙腺摘出ラット・ドライアイモデルの角膜上皮障害に対するジクアスとムコスタの効果各値は，8例の平均値±標準誤差を示す．＊＊：p＜0.01，正常・無点眼群との比較（Studentのt検定）．#：p＜0.05，##：p＜0.01，涙腺摘出・ソフトサンティア群との比較（Tukeyの多重比較検定）．†：p＜0.05，涙腺摘出・ムコスタ群との比較（Tukeyの多重比較検定）．各値は，8あるいは12例の平均値±標準誤差を示す．＄＄：p＜0.01，正常・無点眼群との比較（Studentのt検定）．＊＊：p＜0.01，涙腺摘出・無点眼群との比較（Studentのt検定）．##：p＜0.01，涙腺摘出・ソフトサンティア群との比較（Tukeyの多重比較検定）．¶¶：p＜0.01，涙腺摘出・ムコスタ群との比較（Tukeyの多重比較検定）．200μm200μm涙腺摘出・ソフトサンティア涙腺摘出・ジクアス涙腺摘出・ムコスタ図3眼窩外涙腺摘出ラット・ドライアイモデルの各群の代表的な病理組織像（107）あたらしい眼科Vol.31，No.1，2014107 ＊＃20304050無点眼無点眼ソフトサンティアジクアスムコスタPAS陽性率（%）†＊＃20304050無点眼無点眼ソフトサンティアジクアスムコスタPAS陽性率（%）†正常涙腺摘出図4眼窩外涙腺摘出ラット・ドライアイモデルのPAS陽性細胞率減少に対するジクアスとムコスタの効果各値は，8例の平均値±標準誤差を示す．＊：p＜0.05，正常・無点眼群との比較（Studentのt検定）．＃：p＜0.05，涙腺摘出・無点眼群との比較（Tukeyの多重比較検定）．†：p＜0.05，涙腺摘出・ムコスタ群との比較（Tukeyの多重比較検定）．スタ群に比して統計学的有意差が認められた（いずれもp＜0.01，Tukeyの多重比較検定）．一方，ムコスタ群は無点眼群およびソフトサンティア群に比べて増加傾向を示したが，統計学的有意差は認められなかった（無点眼群：p＝0.43，ソフトサンティア群：p＝0.49，Tukeyの多重比較検定）．3.PAS陽性細胞率の比較図3に正常ラットおよび眼窩外涙腺摘出ラット（無点眼），さらに眼窩外涙腺摘出ラットに対してソフトサンティア，ジクアスあるいはムコスタを4週間点眼したときの眼瞼結膜のPAS染色像を示す．また，図4に各群の眼瞼結膜におけるPAS陽性細胞率を示す．眼窩外涙腺を摘出し8週以上経過したドライアイラットモデルにおいては，眼瞼結膜のPAS陽性細胞数は減少しており，PAS陽性細胞率は正常と比べ有意差を認めた（p＜0.05，Studentのt検定，図4）．4週間の点眼後，ジクアス群では無点眼群と比べ，PAS陽性細胞率の有意な増加を認めた（p＜0.05，Tukeyの多重比較検定）が，ソフトサンティア群およびムコスタ群では有意な変化を認めず（p＞0.05，Tukeyの多重比較検定），さらにジクアス群はムコスタ群に比して有意に高値を示した（p＜0.05，Tukeyの多重比較検定）．III考按本研究では，ドライアイモデル動物である眼窩外涙腺摘出ラットを用いて，ジクアスおよびムコスタの効果を角膜上皮フルオレセイン染色スコア，涙液量およびPAS陽性細胞率を指標に比較検討した．その結果，ジクアスは角膜上皮フル108あたらしい眼科Vol.31，No.1，2014オレセイン染色スコア，涙液量およびPAS陽性細胞率のいずれに対しても改善作用を示し，既報10）と同様の結果が認められた．一方，ムコスタは，いずれの指標においても効果が低かった．ドライアイ治療では，最近は眼表面の層別治療であるTFOTが提唱されており，このためには，眼表面のどの部分が障害されているかを見きわめる眼表面の層別診断（TFOD：tearfilmorienteddiagnosis）が必要になってくる12）．これらの層別診断や層別治療はわが国において，ジクアス，ムコスタという新しいドライアイ治療薬が登場したことで可能になった．ジクアスは涙液4）およびムチン分泌促進作用5,6），膜型ムチン発現促進作用7）を有しており，ムコスタは杯細胞増殖作用8）や膜型ムチン発現促進作用9）を有することから，TFOTでは両剤とも液層および上皮の治療に適していると考えられる．さらにジクアスはMGD治療にも効果があることが報告され13），今後油層の治療剤としても期待される．ジクアホソルナトリウムは結膜上皮細胞上のP2Y2受容体に結合し，細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることでクロライドイオンが涙液側に放出され，浸透圧差が生じ，実質側から涙液側へ水分が誘導される4）．また，結膜杯細胞上のP2Y2受容体にも作用し，同様に細胞内カルシウム濃度を上昇させることで，細胞内に貯蔵されたムチンを分泌させる5）．今回用いたドライアイモデルは，眼窩外涙腺を外科的に摘出しており，涙液量が正常ラットの約半分に低下する．したがって涙液減少型のドライアイモデルと考えられる．このような涙液分泌が減少しているドライアイに対しては，涙液を改善させる点からジクアスが有効であると考えられる．本研究には，いくつかの限界があるが，その一つに角膜障害の評価方法が挙げられる．今回ドライアイモデルの眼表面上皮障害の指標にはフルオレセイン染色を使用したが，他の指標としてローズベンガル染色やリサミングリーン染色がある．特に結膜の評価にはローズベンガル染色やリサミングリーン染色が適しており，結膜杯細胞の増殖作用を有するムコスタ8）はローズベンガル染色では違った結果が得られた可能性がある．また，Toshidaらは，結膜障害モデルにおいてビタミンA点眼後にフルオレセインスコアの改善がローズベンガルスコアの改善よりも先行すると報告している14）．このことからも涙液量増加作用を伴うジクアスではフルオレセイン染色スコアの改善が先行し，それにPAS陽性細胞数の改善効果が続いていると考えられ，ムコスタよりも有意であった可能性がある．今後は，ジクアスとムコスタの使い分けについて検討する必要があると考えられるが，ジクアスおよびムコスタのドライアイ患者に対する報告では，両剤ともに角結膜上皮障害の改善効果を示すが，涙液量に対してはジクアスによる効果は（108） 認められている15）ものの，ムコスタでは改善しないという報告16）がある．したがって，涙液量の減少が著しい症例では，涙液層の安定化に積極的に働きかけるジクアスがより効果を示す可能性が示唆され，また，ムコスタはもともと胃粘膜保護剤であることから上皮障害が有意な症例に有効な可能性が考えられる．今後，臨床報告が蓄積されるに従って明らかになっていくと思われる．文献1）島﨑潤（ドライアイ研究会）：2006年ドライアイ診断基準．あたらしい眼科24：181-184,20072）DEWSmembers：Thedefinitionandclassificationofdryeyedisease：ReportoftheDefinitionandClassificationSubcommitteeoftheInternationalDryEyeWorkshop（2007）.OculSurf5：75-92,20073）横井則彦，坪田一男：ドライアイのコア・メカニズム─涙液安定性仮説の考え方─．あたらしい眼科29：291-297,20124）七條優子，村上忠弘，中村雅胤：正常ウサギにおけるジクアホソルナトリウムの涙液分泌促進作用．あたらしい眼科28：1029-1033,20115）七條優子，篠宮克彦，勝田修ほか：ジクアホソルナトリウムのウサギ結膜組織からのムチン様糖蛋白質分泌促進作用．あたらしい眼科28：543-548,20116）七條優子，阪元明日香，中村雅胤：ジクアホソルナトリウムのウサギ結膜組織からのMUC5AC分泌促進作用．あたらしい眼科28：261-265,20117）七條優子，中村雅胤：培養ヒト角膜上皮細胞におけるジクアホソルナトリウムの膜結合型ムチン遺伝子の発現促進作用．あたらしい眼科28：425-429,20118）UrashimaH,TakejiY,OkamotoTetal：Rebamipideincreasesmucin-likesubstancecontentsandperiodicacidSchiffreagent-positivecellsdensityinnormalrabbits.JOculPharmacolTher28：264-270,20129）TakejiY,UrashimaH,AokiAetal：Rebamipideincreasesthemucin-likeglycoproteinproductionincornealepithelialcells.JOculPharmacolTher28：259-263,201210）FujiharaT,MurakamiT,FujitaHetal：ImprovementofcornealbarrierfunctionbytheP2Y2agonistINS365inaratdryeyemodel.InvestOphthalmolVisSci42：96-100,200111）村上忠弘，中村雅胤：眼窩外涙腺摘出ラットドライアイモデルに対するヒアルロン酸点眼液と人工涙液の併用効果．あたらしい眼科21：87-90,200412）山口昌彦，松本幸裕，高静花ほか：TFOT（TearFilmOrientedTherapy）時代における点眼薬の使い方．FrontiersinDryEye7：8-16,201213）AritaR,SuehiroJ,HaraguchiTetal：Topicaldiquafosolforpatientswithobstructivemeibomianglanddysfunction.BrJOphthalmol97：725-729,201314）ToshidaH,OdakaA,KoikeDetal：Effectofretinolpalmitateeyedropsonexperimentalkeratoconjunctivalepithelialdamageinducedbyn-heptanolinrabbit.CurrEyeRes33：13-18,200815）TauberJ,DavittWF,BokoskyJEetal：Double-maskedplacebo-controlledsafetyandefficacytrialofdiquafosoltetrasodium（INS365）ophthalmicsolutionforthetreatmentofdryeye.Cornea23：784-792,200416）KinoshitaS,AwamuraS,OshidenKetal：Rebamipide（OPC-12759）inthetreatmentofdryeye：Arandomized,double-masked,multicenter,placebo-controlledphaseIIstudy.Ophthalmology119：2471-2478,2012＊＊＊（109）あたらしい眼科Vol.31，No.1，2014109