《原著》あたらしい眼科31（10）：1555.1561，2014c実験的メタノール中毒の電子顕微鏡所見上江田信彦＊1白木邦彦＊2＊1上江田眼科＊2大阪市立大学大学院医学研究科視覚病態学ElectronMicroscopyFindingsforExperimentalMethanolPoisoningNobuhikoUeda1）andKunihikoShiraki2）1）UedaEyeClinic,2）DepartmentofOphthalmologyandVisualSciences,OsakaCityUniversityGraduateSchoolofMedicine目的：実験的メタノール中毒の慢性期の網膜神経節細胞（RGC）と視神経の変化を電子顕微鏡（電顕）で観察する．方法：ラットに葉酸欠乏飼料を5週間与え，メタノール3.5g/kgを腹腔内注射した（中毒群）．対照として，通常の飼料を5週間与え，生理食塩水を腹腔内注射した（対照群）．各群とも投与4，8，12週後に眼球を摘出し，電顕で観察した．結果：中毒群のRGCは4週後には変性し，8週後にはRGCは萎縮し，12週後には減少していた．視神経乳頭と眼窩内視神経では8週後以降で軸索の変性を認めた．結論：実験的メタノール中毒では発症4週後にRGCは変性し，続いて視神経が変性すると推測された．Objective：Toobservechangesinretinalganglioncells（RGC）andopticnerveduringthechronicphaseofexperimentalmethanolpoisoning,usingelectronmicroscopy（EM）.Methods：Subjectratsreceivedintraperitonealinjectionofmethanol3.5g/kgafter5weeksoffolate-deficientdiet（poisoninggroup）.Controlratswerefedanormaldietfor5weeks,thenreceivedintraperitonealinjectionofsaline（controlgroup）.Inbothgroups,eyeballswereextractedat4,8and12weeksafteradministration,forobservationusingEM.Results：Inthepoisoninggroup,RGCshoweddegenerationafter4weeks,atrophyafter8weeksanddecreaseafter12weeks.Degenerationofaxonsintheopticnerveheadandintraorbitalopticnervewasobservedfrom8weeksafteradministrationandbeyond.Conclusion：ThesefindingsindicatethatRGCdegenerationoccurs4weeksafteronsetofexperimentalmethanolpoisoning,andisfollowedbydegenerationoftheopticnerve.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（10）：1555.1561,2014〕Keywords：メタノール，中毒，網膜，視神経，電子顕微鏡．methanol,poisoning,retina,opticnerve,electronmicroscopy.はじめにメタノール中毒は眼に重篤な障害を起こす疾患である．本症はしばしばメタノールの誤飲により起こる．これはメタノールとエタノールの味が似ているためである．メタノールを摂取して18.48時間後にメタノール中毒は発症する．全身的には代謝性アシドーシスにより頭痛・腹痛・昏睡が起こり重篤な場合には死に至る．眼局所には視力低下・瞳孔散大・対光反射の減弱と視神経乳頭の発赤・腫脹と乳頭近傍の網膜の浮腫が起こる．低下した視力は6日以内に回復しはじめる．視力は完全に回復しない場合には再び低下し視神経萎縮を伴い予後不良である1）．メタノールは肝臓でホルムアルデヒドに酸化され，ついでギ酸に酸化される2）．ギ酸はミトコンドリア内の電子伝達系の酵素の一つであるcytochromecoxidaseを阻害する3）．このため，ミトコンドリア内でATP（アデノシン3リン酸）産生の障害や活性酸素の過剰産生4）が起こり，網膜神経節細胞（RGC）が障害されると考えられている．これまでメタノール中毒の動物モデルには霊長類，ラットが用いられてきた．ラットは霊長類に比べてギ酸の代謝能が高いため，モデルの作製にはギ酸の代謝を阻害するために，葉酸欠乏食5）や笑気の投与6）が必要である．いずれのモデルでもメタノール投与後10日以内の急性期についての研究がほとんどで，それ以降の慢性期については生化学的変化7）や視細胞の変性8）については報告されているが，RGCの形態〔別刷請求先〕白木邦彦：〒545-8585大阪市阿倍野区旭町1-4-3大阪市立大学大学院医学研究科視覚病態学Reprintrequests：KunihikoShiraki,M.D.,Ph.D.,DepartmentofOphthalmologyandVisualSciences,OsakaCityUniversityGraduateSchoolofMedicine,1-4-3Asahicho,Abeno-ku,Osaka545-8585,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（133）1555 学的変化についての知見に乏しい．そこで本研究では実験的メタノール中毒の発症4.12週後（慢性期に相当）のRGCと視神経の変化を光学顕微鏡と電子顕微鏡で定性的に評価した．I方法本研究は大阪市立大学大学院動物実験施設委員会の承認を得て行った．メタノールは生理食塩水と混合し30％（W/V）の溶液を調製した．葉酸欠乏飼料にはDyets社製葉酸欠乏飼料#517777を使用した．実験にはウィスターラット雄4週齢を用いた（n＝40）．ラットは以下の四群に分けた．1）通常の飼料を5週間与え，生理食塩水を腹腔内投与した（通常食-生食群）．2）通常の飼料を5週間与え，メタノール（3.5g/kg）を腹腔内投与した（通常食-メタノール群）．3）葉酸欠乏飼料を5週間与え，生理食塩水を腹腔内投与した（葉酸欠乏-生食群）．4）葉酸欠乏飼料を5週間与え，メタノール（3.5g/kg）を腹腔内投与した（葉酸欠乏-メタノール群）．1.ギ酸の定量通常食-生食群，通常食-メタノール群，葉酸欠乏-生食群，葉酸欠乏-メタノール群（いずれのグループもn＝4）を投与2日後に採血し，血清中のギ酸濃度をガスクロマトグラフィーを用いて測定した．2.組織学的検索通常食-生食群，葉酸欠乏-メタノール群とも投与4，8，12週後（いずれのグループもn＝4）に2％グルタールアルデギ酸（mM）14.0012.0010.008.006.004.002.000.00＊＊＊葉酸欠乏通常食葉酸欠乏通常食メタノールメタノール生食生食図1試薬投与2日後の各群の血清中ギ酸濃度＊p＜0.01（Tukey検定）．1556あたらしい眼科Vol.31，No.10，2014ヒド・2％パラホルムアルデヒド・0.1Mリン酸緩衝液の混合液で灌流固定した．ついで，視神経を眼球から1mm離れたところで切断し，視神経，視神経乳頭とその近傍の網膜を採取した．採取した組織を前述した固定液で前固定し，四酸化オスミウムで後固定したのち，樹脂包埋した．試料をウル図2網膜内層の光学顕微鏡写真A：通常食-生食群．B：葉酸欠乏-メタノール群．投与4週後．矢印で示したRGCに細胞質の濃染を認める．C：同投与8週後．矢印で示したRGCに核濃縮と細胞質の空胞を認める．D：同投与12週後．網膜内層は菲薄化し，層構造は不明瞭である．（134） 図3網膜内層の電子顕微鏡写真A：通常食-生食群．B：葉酸欠乏-メタノール群．投与4週後．RGCは腫脹し，細胞質に細胞内小器官が集簇している．C：同投与8週後．RGCは萎縮し，細胞質に空胞を認める．D：同投与8週後．RGCの核は萎縮し，核膜濃染を伴っている．E：同投与12週後．RGCの核の萎縮を認める．（135）あたらしい眼科Vol.31，No.10，20141557 図4視神経乳頭の電子顕微鏡写真A：通常食-生食群．B：葉酸欠乏-メタノール群．投与4週後．通常食-生食群との間に明らかな違いを認めない．C：同投与8週後．軸索の腫脹を認める．D：同投与12週後．軸索に細胞内小器官の集簇を認める．トラミクロトームで1μm厚に薄切した後にトルイジンブルーで染色した．同時に作製した超薄切片を酢酸ウランとクエン酸鉛で二重染色し，電子顕微鏡（H-7500，日立）で観察した．3.統計処理ギ酸の定量に関して，群間の結果の差の検定にはIBM社製統計解析ソフトSPSSを使用してTukey検定を行った．II結果1.血清中ギ酸濃度（図1）血清中のギ酸濃度は通常食-生食群で1.00±0.010mM，通常食-メタノール群で1.18±0.138mM，葉酸欠乏-生食1558あたらしい眼科Vol.31，No.10，2014群で1.37±0.091mM，葉酸欠乏-メタノール群で12.54±1.770mMであった．これらのうち葉酸欠乏-メタノール群のギ酸濃度は他のすべての群に比べて統計学的に有意に大きかった（p＜0.01）．2.網膜内層の光学顕微鏡所見（図2）通常食-生食群ではすべての時点で著変を認めなかった（図2A）．葉酸欠乏-メタノール群では投与4週後にはRGCの細胞質が濃染し，核の大きさも不ぞろいであった（図2B）．投与8週後にはRGCに核濃縮を認め，細胞質は濃染し空胞を伴っていた（図2C）．投与12週後では，8週後に比べて，網膜内層は菲薄化し，神経線維層，神経節細胞層，内網状層の境界は不明瞭になり最内層に空胞を認めた（図（136） 図5視神経の電子顕微鏡所見A：通常食-生食群．B：葉酸欠乏-メタノール群．投与4週後．通常食-生食群との間に明らかな違いを認めない．C：同投与8週後．軸索の収縮を認める．D：同投与12週後．脱髄し，変性脱落した軸索（矢印）を認める．2D）．いずれの時期にも炎症細胞の浸潤を認めなかった．3.網膜内層の電子顕微鏡所見（図3）通常食-生食群ではすべての時点で著変を認めなかった（図3A）．葉酸欠乏-メタノール群では投与4週後にはRGCは腫大し，細胞質にはミトコンドリアと遊離リボゾームが多数存在し電子密度の高い物質を認めた．粗面小胞体は不明瞭であった（図3B）．投与8週後にはRGCは萎縮し核と細胞質の電子密度は高くなり，細胞質に空胞を多数認めた（図3C）．また，RGCの核は萎縮し，核膜濃染を伴っていたが，細胞質は萎縮していないものもみられた（図3D）．投与12週後には細胞質が萎縮したRGCは減少していた．残っているRGCでは細胞質に細胞小器官が集簇し，核は8週後より（137）萎縮していた（図3E）．4.視神経乳頭の光学顕微鏡所見すべての時点で葉酸欠乏-メタノール群と通常食-生食群の間に明らかな差を認めなかった．5.視神経乳頭の電子顕微鏡所見（図4）通常食-生食群ではすべての時点で著変を認めなかった（図4A）．葉酸欠乏-メタノール群は投与4週後には通常食-生食群との間に明らかな差を認めなかった（図4B）．投与8週後には一部の軸索に腫脹を認めた（図4C）．投与12週後には軸索の一部に著明な細胞内小器官の集簇を認めた（図4D）．あたらしい眼科Vol.31，No.10，20141559 6.視神経の光学顕微鏡所見る可能性があると考えられる．すべての時点で，葉酸欠乏-メタノール群と通常食-生食本研究ではラットを用いたメタノール中毒モデルにおいて群の間に明らかな差を認めなかった．慢性期にRGCとその軸索に進行性の変性が起こることを形7.視神経の電子顕微鏡所見（図5）態学的に示した．このことから，本モデルをメタノール中毒通常食-生食群ではすべての時点で著変を認めなかったの慢性期のモデルとして使用できる可能性があることが示唆（図5A）．葉酸欠乏-メタノール群は投与4週後には通常食された．本モデルは予後不良である本疾患の慢性進行期の病-生食群との間に明らかな差を認めなかった（図5B）．投与態の解明と，本疾患の治療の開発とその評価の助けになりう8週後には一部の軸索が収縮していた（図5C）．投与12週ると考えられた．後には軸索の一部が変性脱落し脱髄を伴っていた（図5D）．ただし，治療法の開発と評価にはRGCや軸索の障害の定III考按量的評価が必要である．しかし，本研究の結果は定性研究である．このため，今後は定量研究をする必要がある．また，筆者らは実験的メタノール中毒を電子顕微鏡で観察したと既報の観察期間（10日以内）と本研究の観察期間（4週後以ころ，メタノール投与の4週後以降にRGCに進行性の変性降）との間に隔たりがある．このため，本研究で見いだされを認めた．8週後には視神経乳頭や視神経に変性を認めた．たRGCの変性と既報で述べられている視神経腫脹との関係本研究ではラットに葉酸欠乏飼料を5週間与えたのちに，が不明確である．メタノールを腹腔内投与することによりメタノール中毒モデラットを用いたメタノール中毒モデルでは発症4週後にはルを作製した．このモデルではメタノール投与2日後の血清RGCは変性しており，続いて視神経が変性すると推測され中ギ酸濃度は12.54mMでBaumbachのサルメタノール中た．このことから，本モデルはメタノール中毒の慢性進行期毒モデル（血清ギ酸濃度7.2.14.4mM）9），Leeらのラットの病態の解析や治療法の開発に使用できることが示唆されを用いたモデルの15.6mM10），Eellsのラットを用いたモデた．ルの16.1mM2）とほぼ同等であった．本研究ではメタノール投与の4週後でRGCに進行性の変謝辞：最後に，機材の使用と技術的援助をしていただいた大阪性が認められた．既報では，ラットを用いたメタノール中毒市立大学医学部法医学教室の皆様，大阪医科大学眼科学教室と研モデルではメタノール摂取後数日でRGCの変性を認めたと究機構の皆様にこの場を借りまして，厚く御礼申し上げます．報告されている11,12）．このことからメタノール中毒モデルにおけるRGCの変性はメタノール摂取後数日で現れ，摂取後4週間経過した後も進行する可能性がある．利益相反：利益相反公表基準に該当なし一方，視神経についてはメタノール投与の2.7日後には視神経の軸索の腫脹が発生することがすでに報告されてい文献る6）．本研究では投与4週後の視神経には明らかな変化を認1）BentonCDJr,CalhounFPJr：Theoculareffectsofめず，投与8週後に軸索の変性を認めた．本研究では投与4methylalcoholpoisoning：reportofacatastropheinvolv週後に視神経に明らかな変化を認めなかった点については今ingthreehundredandtwentypersons.TransAmAcad後の検討を要する．OphthalmolOtolaryngol56：875-885,1952その一方で，メタノール中毒の剖検では本研究でみられた2）EellsJT,HenryMM,LewandowskiMFetal：DevelopmentandcharacterizationofarodentmodelofmethanolようなRGCの変性は報告されていない．メタノール中毒のinducedretinalandopticnervetoxicity.Neurotoxicology剖検例では視神経にはメタノール中毒発生後21日で眼窩内21：321-330,2000視神経の軸索の変性が起こるが13），RGCの変化は死後変化3）NichollsP：Formateasaninhibitorofcytochromecoxiとの差を認めることはできないとされている14）．一方，本研dase.BiochemBiophysResCommun67：610-616,19754）RajamaniR,MuthuvelA,SenthilvelanMetal：Oxidative究では死後変化を最小限にするために灌流固定を用いて組織stressinducedbymethotrexatealoneandinthepresence学的検索を行った．このため，剖検では死後変化のために見ofmethanolindiscreteregionsoftherodentbrain,retinaいだせなかったRGCの変性を見いだすことができた可能性andopticnerve.ToxicolLett165：265-273,2006がある．5）LeeEW,GarnerCD,TerzoTS：Aratmodelmanifestingmethanol-inducedvisualdysfunctionsuitableforbothまた，近年ヒトのメタノール中毒にて，発症1カ月後に光acuteandlong-termexposurestudies.ToxicolApplPhar干渉断層計（OCT）により黄斑部の神経節細胞層＋内網状層macol128：199-206,1994の菲薄化が報告された15）．このことからも，本研究で認めら6）MurrayTG,BurtonTC,RajaniCetal：MethanolpoisonれたRGCの変性はヒトのメタノール中毒の慢性期には生じing.Arodentmodelwithstructuralandfunctionalevi1560あたらしい眼科Vol.31，No.10，2014（138） denceforretinalinvolvement.ArchOphthalmol109：1012-1016,19917）Gonzalez-QuevedoA,ObregonF,UrbinaMetal：Effectofchronicmethanoladministrationonaminoacidsandmonoaminesinretina,opticnerve,andbrainoftherat.ToxicolApplPharmacol185：77-84,20028）ChirapapaisanN,UiprasertkulM,ChuncharuneeA：TheeffectofcoenzymeQ10andcurcuminonchronicmethanolintoxicationinducedretinopathyinrats.JMedAssocThai95（Suppl4）：S76-S81,20129）BaumbachGL,CancillaPA,Martin-AmatGetal：Methylalcoholpoisoning.IV.Alterationsofthemorphologicalfindingsoftheretinaandopticnerve.ArchOphthalmol95：1859-1865,197710）LeeEW,GarnerCD,TerzoTS：Animalmodelforthestudyofmethanoltoxicity：comparisonoffolate-reducedratresponseswithpublishedmonkeydata.JToxicolEnvironHealth41：71-82,199411）SahinA,KayaS,TurkcuGetal：Theeffectsofcaffeicacidphenethylesterinacutemethanoltoxicityonratretinaandopticnerve.CutanOculToxicol32：263-267,201312）El-BakaryAA,El-DakrorySA,AttallaSMetal：Ranitidineasanalcoholdehydrogenaseinhibitorinacutemethanoltoxicityinrats.HumExpToxicol29：93-101,201013）NaeserP：Opticnerveinvolvementinacaseofmethanolpoisoning.BrJOphthalmol72：778-781,198814）SharpeJA,HostovskyM,BilbaoJMetal：Methanolopticneuropathy：ahistopathologicalstudy.Neurology32：1093-1100,198215）馬郡幹也，下田幸紀，秋山英雄ほか：メタノール視神経症における網膜神経節細胞の消失．眼科55：1159-1166,2013＊＊＊（139）あたらしい眼科Vol.31，No.10，20141561