あたらしい眼科

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：857.861，2016c点眼用添加物EDTAが種々保存剤の抗菌力および角膜傷害性へ与える影響長井紀章＊1田辺航＊1辻朗子＊1勝井結美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室EffectofEDTAonAntimicrobialActivityandCornealToxicityofVariousEyedropPreservativesNoriakiNagai1）,WataruTanabe1）,AkikoTsuji1）,YumiKatsui1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine今回筆者らは，一般的な点眼用添加剤である安定化剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が，各種保存剤の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．保存剤はベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩素酸ナトリウム（SC）およびクロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）の計5種を用いた．また，抗菌力および角膜傷害性の確認には大腸菌（E.coli，ATCC8739），ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた．その結果，EDTA併用下において，BACの抗菌力上昇が認められたが，細胞傷害性に変化はみられなかった．一方，他の4剤の保存剤では，EDTAとの併用により抗菌力および細胞傷害性の低下がみられた．以上，点眼薬処方におけるEDTA使用は，保存剤の抗菌力や細胞傷害性に影響を与えることを明らかとした．本研究成果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）ontheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofvariouspreservatives,usingEscherichiacoli（E.coli,ATCC8739）andculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）.Benzalkoniumchloride（BAC）,methylparahydroxybenzoate（MP）,propylparahydroxybenzoate（PP）,sodiumchlorite（SC）andchlorhexidinegluconate（CHG）wereusedaspreservativesinthisstudy.AlthoughtheantimicrobialactivityofBACwasincreasedbytheadditionofEDTA,thecornealtoxicityofBACwassimilartothatofthecombinationofEDTAandBAC.Ontheotherhand,boththeantimicrobialactivityandcornealtoxicityofMP,PP,SCandCHGweredecreasedbytheadditionofEDTA.TheseresultsshowthattheuseofEDTAasanophthalmicpharmaceuticaladditiveaffectstheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofpreservatives.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseinthedesigningofeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：857.861,2016〕Keywords：保存剤，エチレンジアミン四酢酸，抗菌力，角膜毒性，点眼薬．preservatives,ethylenediaminetetraaceticacid,antimicrobialactivity,cornealtoxicity,eyedrops.はじめに医薬品は主成分となる薬剤（主剤）のみでは製剤とはいえず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる．点眼薬においても同様であり，一般的に点眼薬には可溶化剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリソルベート80，ポビドンなど），安定化剤（ポリソルベート80，ポビドン，エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など），等張化剤（塩化ナトリウム，ブドウ糖，マンニトールなど），緩衝剤（酢酸ナトリウム水和物，炭酸水素ナトリウム，ホウ酸など），pH調節剤（希塩酸，水酸化ナトリウムなど），保存剤（ベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（97）857素酸ナトリウム（SC），クロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）など）が含まれる．なかでもこれら点眼薬中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．現在市販されている点眼薬では，保存剤の約7割にBACが用いられ，約2割にパラベン類（MPやPP），そしてその他の約1割にSCやCHGなどが使用されている．しかし，これら保存剤の長期連続投与は，使用後の“しみる”“かすむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎とい(，)った眼局所の副作用発現に繋がるため，臨床において問題視されている1）．したがって，抗菌力が高く，角膜傷害性の少ない眼にやさしい新たな製剤処方の開発が望まれている．このような背景から，眼科領域では1回使い切りタイプの容器やPFデラミ容器R（容器を二層構造とし点眼薬に添加される保存剤を不要にしたもの）などが市販されている．また，配合剤や細胞毒性の低い新規保存剤の開発のための研究も進められている1）．一方，製剤処方において，主薬と添加物の相互作用についてはいまだ十分に検討はなされておらず，添加物が各種保存剤の抗菌力や角膜毒性に与える影響を明確にすることは，眼にやさしく，高い抗菌力を維持する製剤処方の確立において非常に重要である．そこで今回，基礎研究として代表的点眼製剤用添加物であるEDTAが保存剤各種の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．I対象および方法1.使用薬物点眼用添加物である安定化剤EDTAと保存剤として多用されているBAC，MP，PP，SCおよびCHGの計6種を用いた．各種試験溶液は，EDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）を精製水で溶解し，細孔径0.2μmのメンブランフィルターで濾過滅菌することで調製した．角膜細胞傷害性の評価に用いたEDTAの濃度は，過去の報告に従い2），眼科用最大許容投与量（0.127％）以下である0.1％（1mg/mL）とした2）．また，各種保存剤濃度は，臨床で用いられる濃度を参考に，いずれも0.005％（50mg/mL）とした．2.最小発育阻止濃度（MIC）の測定試験菌株には，独立行政法人製品評価技術機構から購入した大腸菌（E.coli，ATCC8739）を用い，MICの測定は微量液体希釈法に従い行った1）．また，感受性測定用培地はMuellerHintonBroth（日本ベクトン・ディッキンソン）を用いた．実験操作は以下のようにして行った．まず，E.coliを寒天培地上で18.24時間培養（35±1℃）後，滅菌生理食塩液にて試験菌が1×108個含まれる菌液を調製し，薬液と1×106個/mLの生菌数になるように混合した（試験液）．これらの試験液を含む容器を22.5±2.5℃の条件下で遮光保存し，28日後の試験溶液中生菌数の確認を行った．生菌数の858あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016確認にはカンテン平板混釈法を用い，対照に用いた薬剤不含有培地での菌の発育を確認後，菌の発育が肉眼的に認められないwellのうち最小の薬剤濃度をMICとした1）．3.角膜上皮細胞傷害性の評価培養細胞は理化学研究所より購入した不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，角膜細胞傷害性の評価は，筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従った2.4）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellに100mLの培地およびCellCountReagentSF（ナカライラスク社製）20mLを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理後，450nmの吸光度（Abs）を測定した．薬剤処理後の細胞死亡率（％）は次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）4.統計解析実験は1群に対し8回（検体）行い，得られたデータは平均値±標準誤差（SE）として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.EDTA添加に伴う種々保存剤の抗菌力の変化表1はEDTAおよび種々保存剤のMICを示す．また，図1にはEDTAと種々保存剤併用処理時における抗菌力の変化を示す．EDTAのMICは700mg/mLであり，今回使用した保存剤のMICはBAC＞CHG＞Mp＞SC＞PPの順であった．これら保存剤にEDTAを添加したところ，MP，PP，SCおよびCHGにおいて抗菌力の低下がみられた．一方，BACではEDTAの添加により抗菌力の増大が認められ，MICより低い濃度においても十分な抗菌力を示した．表1眼科用添加物のE.coliに対する最小阻害濃度眼科用添加物MIC（μg/mL）BAC（ベンザルコニウム塩化物）16MP（パラオキシ安息香酸メチル）6PP（パラオキシ安息香酸プロピル）1.25SC（亜塩素酸ナトリウム）5CHG（クロルヘキシジングルコン酸塩）8EDTA（エチレンジアミン四酢酸）700（98）A：BACB：MB：MPC：PP1001008080保存効力なし●保存効力ありPP濃度（μg/mL）保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）SC濃度（μg/mL）BAC濃度（μg/mL）細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）CHG濃度（μg/mL）MP濃度（μg/mL）604020604020000010020030040050001002003004005000100200300400500EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）D：SCE：CHG100保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり図1EDTAが種々保存剤の抗菌力に与え001002003004005000100200300400500る影響EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）破線は各保存剤自身（単独）のMICを示す．0A：BACB：MPC：PP8080606040402020MP●MPwithEDTA＊＊00306090120時間（sec）00306090120時間（sec）PP●PPwithEDTAE：CHGD：SC00306090120時間（sec）BAC●BACwithEDTA808080707070細胞死亡率（％）606060505050404040303030202020＊101010SC●SCwithEDTA＊＊CHG●CHGwithEDTA図2EDTA（0.1％）が各種保存剤（0.005208080706050403020＊70＊60504030％）の角膜細胞傷害性に与える影響10細胞死亡率は式（1）を用いて算出した．平0030609012000306090120均値±標準誤差，n＝8．＊p＜0.05vs.コン時間（sec）時間（sec）トロール群（EDTA非添加群）．2.EDTA添加に伴う種々保存剤の角膜細胞傷害性のBAC≒CHG＞SC≫MPの順であった．一方，パラベン類で変化あるPPにおいては処理120秒まで細胞傷害は認められなか図2はEDTAと種々保存剤処理時におけるHCE-T細胞ったが，処理180秒後では細胞傷害がみられ，その細胞死の死亡率を示す．BAC，MP，SCおよびCHGでは処理時間亡率は13.9±2.1（平均値±SE）であった．これら種々保存の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，その傷害性は剤にEDTAを添加したところ，BAC処理群ではその細胞傷（99）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016859害性に大きな影響はみられなかった．このBAC処理群の結果とは異なり，MP，SCおよびCHG処理群ではEDTAの併用処理により，細胞毒性が有意に低下した．また，PPおよびEDTA併用処理群では，処理0.180秒間において細胞傷害性はみられなかった．III考按EDTAは点眼薬中に多く含まれる安定化剤であり，BAC，MP，PP，SC，CHGは点眼製剤の製造において多用される保存剤である．本研究ではEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の組み合わせが，保存剤の有する抗菌力および角膜上皮細胞毒性（副作用）へ与える影響について明らかにするために検討した．まず，今回用いたEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の抗菌力および角膜上皮細胞傷害性について検討したところ，EDTAの抗菌力はMIC700mg/mLと低かったが，各種保存剤単独では強い抗菌力が確認できた．一方，0.005％における各種保存剤の角膜上皮細胞傷害性は，BAC≒CHG＞SC≫MPの順であり，PPにおいては処理120秒間で細胞傷害性はみられず，毒性は非常に低いものであった．一般に，保存剤の抗菌メカニズムと角膜細胞毒性とは密接にかかわっていることが知られている．今回選択したBACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白質の変性，呼吸系の阻害を引き起こす5.7）．また，パラベン類（MPやPP）の抗菌作用発現機構は，膜イオン透過性亢進による膜電位の消失もしくはミトコンドリアの呼吸機能障害によることが先行研究により示唆されており，アルキル側鎖の長さが長い程細胞毒性が低下することが知られている8,9）．これらパラベン類のアルキル側鎖の長さと細胞毒性の関係は，今回示したMP，PPの結果と同様であった（表1および図1）．さらに，SCはアミノ酸のスルフィド（S-H）結合と酵素のジスルフィド（S-S）結合を酸化して細胞の機能を破壊するとともに，細胞膜を直接的に破壊して抗菌活性を示すとされており10），CHGは細胞膜に吸着し，細胞膜傷害と細胞質の漏洩を起こすとともに，酵素蛋白質に吸着して活性阻害を起こすことが知られている11）．一方，本研究では抗菌力の評価に，環境中に存在する菌類の主要な種の一つであるグラム陰性の桿菌E.coliを用いた．グラム陰性菌は細胞膜と外膜の2つの脂質膜に包まれている．この外膜はリポ多糖，リン脂質および数種の蛋白質などからなり，2価陽イオンでそれらの一部が結びつけられているため，陽イオンのキレーターであるEDTAを作用させると，外膜を構成する成分の一部が遊離し，外膜に障害が認められる12,13）．このような膜の傷害によって，外膜により膜内への透過が抑制されていた薬剤が容易に外膜を通過できるよ860あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016うになり，薬効および毒性が高まることが報告されている．したがって，E.coliにEDTAと各種保存剤を併用した際には，薬剤のE.coliに対する膜透過性亢進により抗菌力が高まるが，外膜を持たない角膜上皮細胞に対する細胞傷害性は大きく変化しないものと考えられた．本研究においても，BACとEDTAの組み合わせでは，抗菌力は上昇したが，角膜傷害性においては有意な差はみられなかった．このBACとEDTAの組み合わせの結果とは異なり，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGでは，EDTA併用により抗菌力および角膜傷害性の低下が認められた．EDTA併用処理では薬剤の膜透過性亢進が考えられるが，E.coliに対する抗菌力の低下と角膜上皮細胞における細胞毒性の軽減がともにみられたことから，パラベン類（MP，PP），SCやCHGの薬効（抗菌力）や副作用発現（細胞傷害性）には2価陽イオンがかかわっており，陽イオンのキレーターであるEDTAとの併用はそれらの効力を低下させる可能性が示唆された．以上，点眼薬の処方設計において，添加物EDTAの組み合わせは保存剤の抗菌力，角膜傷害性に影響を及ぼすことを見出した．今後，E.coli以外の菌類に対してどのような影響を与えるかを検討するとともに，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGの保存効果機構と2価陽イオンの関係についても検討を進めていく予定である．本研究結果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20102）長井紀章，村尾卓俊，伊藤吉將ほか：点眼薬含有添加剤であるポリソルベート80及びEDTA点眼が角膜上皮傷害治癒へ与える影響．あたらしい眼科27：1299-1302,20103）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20154）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Ananoparticleformulationreducesthecornealtoxicityofindomethacineyedropsandenhancesitscornealpermeability.Toxicology319：53-6220145）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20016）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,（100）19997）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,20018）BredinJ,Davin-RegliA,PagesJM：PropylparabeninducespotassiumeffluxinEscherichiacoli.JAntimicrobChemother55：1013-1015,20059）NakagawaY,MoldeusP：Mechanismofp-hydroxybenzoateester-inducedmitochondrialdysfunctionandcytotoxicityinisolatedrathepatocytes.BiochemPharmacol55：1907-1914,199810）小林正枝，秋山茂，岩下正人ほか：亜塩素酸ナトリウム製剤の殺菌効力に関する検討．食品衛生学雑誌30：367374,198911）第十六改正日本薬局方解説書廣川書店，C-1563,201112）AsbellMA,EagonRG：Roleofmultivalentcationsintheorganization,structure,andassemblyofthecellwallofPseudomonasaeruginosa.JBacteriol92：380-387,196613）RogersSW,GillelandHEJr,EagonRG：Characterizationofaprotein-lipopolysaccharidecomplexreleasedfromcellwallsofPseudomonasaeruginosabyethylenediaminetetraaceticacid.CanJMicrobiol15：743-748,1969＊＊＊（101）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016861

《第33回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科31（5）：729.732，2014cウサギ赤血球を用いたベンザルコニウム塩化物の傷害性評価とセリシンによる保護効果長井紀章＊1藤田裕美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室PreventiveEffectofSericinonBenzalkoniumChlorideStimulationofRabbitRedBloodCellsNoriakiNagai1）,HiromiFujita1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）andYoshikazuShimomura2）1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine筆者らはこれまで，点眼用保存剤ベンザルコニウム塩化物（BAC）とセリシンを併用することで，長期連続使用可能で安全な点眼用保存剤になりうることを報告してきた．本研究では，ウサギ赤血球を用いた細胞傷害評価モデルにより，セリシンでBAC細胞傷害軽減効果について検討を行った．BAC単独処理群では，10μg/mlBAC処理で溶血率は90.1％となったが，セリシン添加によりBACの溶血作用は軽減され，10μg/mlBAC溶液に0.5％セリシンを併用処理した際の溶血率は17.5％であった．また，セリシンによるBAC細胞傷害軽減作用は濃度依存的に増加した．これら結果とは異なり，セリシンで30分間前処理したものでは，BAC刺激に伴う溶血に対し保護効果を示さなかった．以上，セリシン併用処理によるBACの細胞傷害抑制機構の一つに，刺激に対する細胞膜保護が起因することを明らかとした．Wepreviouslyreportedthattheadditionofsericindecreasesthecornealdamagecausedbybenzalkoniumchloride（BAC）,andthatapreservativesystemcomprisingBACandsericinprovideseffectivetherapyforpatientsrequiringlong-termeyedroptreatment.Inthepresentstudy,weinvestigatedthepreventiveeffectofsericinonBACstimulationofrabbitredbloodcells.Thehemolysisrateinredbloodcellswas90.1％after10μg/mlBACstimulationfor1h.Weadded0.5％sericintoaffecttherateofhemolysisbyBACstimulation；thehemolysisrateundercombinationtreatmentwith10μg/mlBACand0.5％sericinwas17.5％.Inaddition,thepreventiveeffectofsericinincreasedwithsericinconcentration.Ontheotherhand,thepreventiveeffectagainstBACstimulationwasnotobservedwithsericinpretreatmentfor30min.Theseresultsshowthattheadditionofsericinenhancescellmembranetolerance.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（5）：729.732,2014〕Keywords：セリシン，ベンザルコニウム塩化物，ウサギ赤血球，細胞傷害，保存剤．sericin,benzalkoniumchloride,rabbitredbloodcells,cellstimulation,preservative.はじめに眼科領域における薬物療法の中心は点眼薬である．点眼薬の多くは，全身投与薬としてすでに開発されている薬物を点眼薬として製剤化することで開発されてきた．しかし点眼薬の主成分となる薬物（主剤）のみでは点眼薬は製剤として成り立たず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる1）．したがって製剤学的観点から点眼薬について考える際には，その点眼薬に含まれる添加剤の種類，添加目的（効果），傷害性（副作用）についても常に考慮しなければならない．一般的に点眼薬には保存剤〔ベンザルコニウム塩化物（BAC）など〕，等張化剤（塩化ナトリウム，ホウ酸，グリセリンなど），緩衝剤（リン酸緩衝液，ホウ酸など），また必要であれば，界面活性剤（ポリソルベート80など），安定化剤〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（103）729〔エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など〕，粘稠化剤〔ポリビニルアルコール（PVA），ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロースなど〕などが含まれる1）．これら添加剤のなかでも保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．特に，BACは眼科領域において代表的な保存剤であり，パラベン類やクロロブタノールなどの他の保存剤と比較し保存効力が高く，水溶性で化学的にも安定であり，扱いやすいことから点眼薬領域の約7割で使用されている2）．しかしながら，BACは細胞傷害性を有し，長期使用により薬剤性角膜上皮傷害がみられることから，近年臨床において問題視されている．このような背景から，点眼回数を減らすなどBAC曝露量を減らすといった試みがなされているが，長期にわたり多剤併用を必要とする眼疾患治療（緑内障など）においては，これらの対策はむずかしいのが現状である3,4）．また，近年ではBACを含有しないポリクォッド（塩化ポリドロニウム）およびSofZia（塩化亜鉛，ホウ酸を含むソルビトール緩衝剤保存システム）をそれぞれ保存剤として用いたデュオトラバRやトラバタンズRのような製剤が開発・市販されているが5），上記保存システムはBACと比較し保存効力が低いため，欧米など日本以外の国々では使用が認可されていないのが現状である．一方，微生物の侵入を防ぐ特殊な容器を使用した保存剤非含有製剤も市販されているが，使用法およびコスト面で問題があるため，BACを基盤とした目に優しい点眼用保存システムの開発が切望されている．筆者らはこれまで，カイコ繭由来の絹タンパク質であるセリシンに注目し，セリシンとBAC併用による点眼用保存システム（BAC/セリシン保存システム）が，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発へ有用であることを報告してきた6）．今回，このBAC/セリシン保存システムの細胞傷害保護機構を明確にすべく，ウサギ赤血球モデルを用い，セリシンのBAC細胞傷害保護効果について検討を行った．I対象および方法1.実験動物実験には2.5.3.0kg日本白色種雌性ウサギを用いた．これらウサギは25℃に保たれた環境下で飼育し，飼料（飼育繁殖固形飼料CR-3，日本クレア）および水は自由に摂取させた．動物実験は，近畿大学実験動物規定に従い行った．2.試薬セリシン（30kDa）はセーレン（株）から供与されたものを用いた．BACおよびヘパリンナトリウムは和光純薬，リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco’sPhosphateBufferedSaline：PBS）はGIBCOから購入したものを用いた．3.ウサギ赤血球標品の調製ウサギ耳静脈より採血した血液1mlと100μlヘパリン730あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014（10mg/ml）を混和後，遠心分離（3,000rpm，37oC，5min）を行った．その後上清を捨て，沈殿とPBSが1：3となるようにPBSを加え，さらに遠心分離（2,000rpm，37oC，5min）を行い，沈殿の回収を行った．これら洗浄操作を2回繰り返したものを赤血球標品として本実験に用いた．陽性対照とした完全溶血赤血球は，精製水2mlに赤血球標品40μlを添加することで作製した．4.浸透圧刺激に伴う溶血率変化の測定上記方法中「3．ウサギ赤血球標品の調製」にて示した赤血球標品40μlを0.1.0.5％セリシン含有または非含有の食塩水（125.215mOsm）2ml中に加え，37oCにて1時間インキュベートを行った．その後，遠心分離（2,300rpm，37oC，5min）にて上清を採取し，576nmにおける吸光度の測定をすることで浸透圧刺激に伴う溶血率変化を示した．また，セリシン前処理時には，赤血球標品を0.1.0.5％セリシン含有または非含有の生理食塩水にて30分間インキュベート後，生理食塩水にて洗浄を行い，上記に示した125.215mOsm食塩水により浸透圧刺激を行った．本研究では，処理後の溶血率（％）を次式（1）により算出した．溶血率（％）＝（試験液吸光度.空試験吸光度）/（陽性対照吸光度.空試験吸光度）×100（1）5.BAC処理に伴う溶血率変化の測定上記方法中「3．ウサギ赤血球標品の調製」にて示した赤血球標品40μlを0.1.0.5％セリシンおよびBAC含有または非含有の生理食塩水（BAC濃度，8.12μg/ml）2ml中に加え，37oCにて1時間インキュベートを行った．その後，遠心分離（2,300rpm，37oC，5min）にて上清を採取し，576nmにおける吸光度の測定をすることでBAC刺激に伴う溶血率変化を示した．また，セリシン前処理時には，赤血球標品を0.1.0.5％セリシン含有または非含有の生理食塩水にて30分間インキュベート後，生理食塩水にて洗浄を行い，上記に示した8.12μg/mlBACにより刺激を行った実験に用いた．処理後の溶血率（％）算出には上記式（1）を用いた．6.統計学的処理実験結果は平均値±標準誤差（SE）で表した．有意差検定はJAMVer.5.1（日本SAS協会）コンピュータプログラムを用いて行った．各々の実験値はDunnettの多群間比較により解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.セリシンによるBAC細胞傷害保護効果図1は浸透圧変化に伴う溶血性変化とセリシンの保護効果を示す．等張時，赤血球の溶血はみられなかったが，浸透圧を下げていくことで溶血が認められた．これら溶血は200mOsm以下でみられ，140mOsmではほぼ完全に溶血した（104）100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）Osmoticpressure（mOsm）A：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）B：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）Osmoticpressure（mOsm）A：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin100806040200125140155170185200215Hemolyticratio（%）B：Saline：0.1%sericin：0.25%sericin：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊Osmoticpressure（mOsm）図1セリシン前処理（A）または併用処理（B）が浸透圧変化による赤血球の溶血へ与える影響平均値±標準誤差，n＝5.6，＊p＜0.05,vs.Saline．（図1A）．一方，セリシンを併用処理することで，これら赤血球溶血の保護効果がみられ，155mOsmの条件下0.5％セリシン併用処理群の溶血率は16.3％であり，非処理群と比較し有意に低値を示した（図1B）．図2はBAC刺激に伴う溶血性変化とセリシンの保護効果を示す．BAC刺激により溶血が認められ，8μg/mlBAC刺激による溶血率は23.3％，10μg/mlBAC刺激では90.1％であった．セリシン併用処理はBAC刺激に対しても細胞傷害保護効果を示し，8μg/mlBAC刺激時では溶血はほとんど認められず，10μg/mlBAC刺激時における非処理群のそれの17.5％であった．また，浸透圧変化およびBAC刺激時におけるセリシンの保護効果は濃度依存的であった．これらセリシン併用処理実験の結果とは異なり，セリシンを30分間前処理したものでは，浸透圧およびBAC刺激に伴う溶血に対し保護効果を示さず，今回用いたいずれの濃度においても，溶血挙動に差はみられなかった（図1Aおよび図2A）．III考按セリシンは，絹糸原糸タンパク質の約20％を占める主要成分である．従来，セリシンは絹糸精製（精練）段階で廃棄されてきた物質であったが，保湿性や抗酸化能をもつことが明らかとなり，近年では産業資材や化粧品などに利用されて（105）100806040200Hemolyticratio（%）A：Saline■：0.1%sericin■：0.25%sericin■：0.5%sericin89101112BACconcentration（mg/ml）10080604020089101112Hemolyticratio（%）B：Saline■：0.1%sericin■：0.25%sericin■：0.5%sericin＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊BACconcentration（mg/ml）図2セリシン前処理（A）または併用処理（B）がBAC刺激による赤血球の溶血へ与える影響平均値±標準誤差，n＝5.8，＊p＜0.05,vs.Saline．いる7）．また，皮膚炎などのアレルギー防止作用を有することも見出され，生物化学領域においても注目されている8,9）．筆者らもこれまで，このセリシン溶液点眼により角膜傷害治癒促進効果がみられ，1.5％のセリシン溶液が角膜傷害治療薬として有用であることを見出してきた10）．さらに，BACとセリシン併用によりBACの角膜傷害性が緩和され，0.1％のセリシンを用いることで，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発に繋がる可能性を報告してきた6）．本研究では，点眼用保存剤BACとこのセリシンからなるBAC-セリシン点眼用保存システムの開発研究として，ウサギ赤血球モデルを用い，セリシンのBAC細胞傷害保護効果について検討を行った．赤血球は，両面中央が凹んだ円盤状の形をしており，核を持たないことから細胞分裂などを行わないのが特徴である．このため，赤血球を用いることで，薬剤自身の直接的な刺激性やそれに対する保護作用の評価が可能である．そこで今回，この赤血球モデルを用いて浸透圧およびBAC刺激に対するセリシンの細胞保護効果を評価した．まず，浸透圧刺激に対するセリシンの細胞保護効果を検討したところ，等張時，赤血球の溶血はみられなかったが，浸透圧を下げていくことで溶血が認められた．また，セリシンを併用処理することで，赤血球溶血の保護効果がみられ，これら保護効果は濃あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014731度依存的であった．点眼用保存剤として用いられるBAC刺激に対するセリシンの細胞保護効果を検討したところ，本実験条件において，7μg/ml以上のBAC刺激により溶血が認められ，8μg/mlBAC刺激時の溶血率は23.3％，10μg/mlBAC刺激では90.1％の溶血率であった．さらに，浸透圧刺激と同様，セリシン併用処理はBAC刺激に対しても細胞傷害保護効果を示し，8μg/mlBAC刺激時では溶血はほとんど認められず，10μg/mlBAC刺激では非処理群のそれの17.5％であった．また，BAC刺激に対してもセリシンによる保護効果は濃度依存的であった．これらの結果から，セリシンはBACだけでなく，浸透圧などの外部刺激に対しても細胞保護効果を有し，併用処理により細胞傷害を有する点眼製剤の毒性軽減に有用であることが示唆された．一方，セリシンを前処理した際には，浸透圧およびBAC刺激に対するセリシンの保護効果はみられず，セリシン前処理群と未処理群間で浸透圧，BAC刺激に対し同様の溶血性を示した．これら前処理によりセリシンの細胞保護効果が得られなかった理由として，セリシンによる保護効果が細胞膜の活性化によるものではなく，刺激因子に対する直接的な抵抗性増加に起因するためと考えられた．筆者らはこれまで，目に優しく長期連続使用可能な保存剤の開発を目指した研究にて，invivoおよびinvitro細胞傷害性評価実験系を確立し11,12），BACへのセリシン添加が，BAC本来の使用目的である保存効果，主薬の角膜透過性亢進能および主薬の薬効に対し影響を及ぼさないことを報告してきた6）．これら以前および今回の結果から，BAC/セリシン点眼用保存システムはBACの角膜上皮傷害性を抑制するとともに，点眼用保存剤として十分な高い保存効力を有し，主成分の角膜透過性および薬効に影響を及ぼさず，またBACの細胞傷害抑制機構の一つに，セリシンの膜保護能が関わっているものと考えられた．本報告は目に優しく長期連続使用可能な保存剤を開発するうえで有用であるものと考えられる．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）川嶋洋一：点眼薬の設計思想．眼科NewInsight第2巻点眼薬─常識と非常識─（木下茂ほか）．p6，メジカルビュー社，19942）WhitsonJT,VarnerDL,NetlandPA：Glaucomadrugsandtheocularsurface.RevOphthalmol11：69-77,20063）PisellaPJ,PouliquenP,BaudouinC：Prevalenceofocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservativefreeglaucomamedication.BrJOphthalmol86：418-423,20024）JaenenN,BaudouinC,PouliquenPetal：Ocularsymptomsandsignswithpreservedandpreservative-freeglaucomamedications.EurJOphthalmol17：341-349,20075）湖崎惇，大谷伸一郎，鵜木一彦ほか：トラボプロスト点眼液の臨床使用成績眼表面への影響．あたらしい眼科26：101-104,20096）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Decreaseincornealdamageduetobenzalkoniumchloridebytheadditionofsericinintotimololmaleateeyedrops.JOleoSci62：159166,20137）DashR,AcharyaC,BinduPCetal：Antioxidantpotentialofsilkproteinsericinagainsthydrogenperoxide-inducedoxidativestressinskinfibroblasts.BMBRep41：236241,20088）TsubouchiK,IgarashiY,TakasuYetal：Sericinenhancesattachmentofculturedhumanskinfibroblasts.BiosciBiotechnolBiochem69：403-405,20059）TeradaS,NishimuraT,SasakiMetal：Sericin,aproteinderivedfromsilkworms,acceleratestheproliferationofseveralmammaliancelllinesincludingahybridoma.Cytotechnology40：3-12,200210）NagaiN,MuraoT,ItoYetal：EnhancingeffectsofsericinoncornealwoundhealinginOtsukaLong-EvansTokushimaFattyratsasamodelofhumantype2diabetes.BiolPharmBull32：1594-1599,200911）NagaiN,MuraoT,OeKetal：Invitroevaluationforcornealdamagesbyanti-glaucomacombinationeyedropsusinghumancornealepithelialcell（HCE-T）.YakugakuZasshi131：985-991,201112）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,2010＊＊＊732あたらしい眼科Vol.31，No.5，2014（106）