0910-1810/10/\100/頁/JCOPY（99）1581《原著》あたらしい眼科27（11）：1581.1585，2010c〔別刷請求先〕福田正道：〒920-0293石川県河北郡内灘町大学1-1金沢医科大学眼科学Reprintrequests：MasamichiFukuda,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,1-1Daigaku,Uchinadamachi,Kahoku-gun,Ishikawa-ken920-0293,JAPAN角膜抵抗測定装置によるプロスタグランジン関連点眼薬の角膜障害の評価福田正道＊1佐々木洋＊1高橋信夫＊1吉川眞男＊4北川和子＊1佐々木一之＊1,2,3＊1金沢医科大学眼科学＊2金沢医科大学総合医学研究所環境原性視覚病態研究部門＊3東北文化学園大学医療福祉学部リハビリテーション学科視覚機能学＊（4有）メイヨーEvaluationofCornealDisordersCausedbyProstaglandinDerivativeOphthalmicSolutionsUsingaCornealResistanceMeasuringDeviceMasamichiFukuda1）,HiroshiSasaki1）,NobuoTakahashi1）,MasaoYoshikawa4）,KazukoKitagawa1）andKazuyukiSasaki1,2,3）1）DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,2）DivisionofVisionResearchforEnvironmentalHealth,MedicalResearchInstitute,KanazawaMedicalUniversity,3）VisualScienceCourse,DepartmentofRehabilitation,FacultyofMedicalScienceandWelfare,TohokuBunkaGakuenUniversity,4）MayoCorporation目的：角膜抵抗測定装置を用いて，4種類のプロスタグランジン関連薬の家兎眼の角膜上皮に対する安全性（invivo）を評価し，さらに培養兎由来角膜細胞障害性（invitro）との相関性を検討した．方法：培養兎由来角膜細胞株にキサラタンR点眼液（以下，キサラタン），ルミガンR点眼液（以下，ルミガン），トラバタンズR点眼液（以下，トラバタンズ）あるいはトラバタンR点眼液（以下，トラバタン）を0～60分間接触後の生存細胞数を測定し，各点眼薬の50％細胞致死時間（CDT50）を算出した．角膜抵抗測定法では，家兎の結膜.内に各点眼液を15分ごと3回点眼し，点眼終了2分，30分，60分後の角膜抵抗（CR）を測定した．結果：各点眼薬のCDT50（分）はトラバタンズ51.0分，ルミガン50.5分，トラバタン25.3分，およびキサラタン11.6分の順であった．CR測定ではトラバタンの［点眼後CR×100/点眼前CR］（CR比）は点眼終了で30分後81.0％，キサラタンは点眼終了2分後で82.0％でいずれも有意に低下した（p＜0.05）．一方，トラバタンズおよびルミガンではCR比の低下はみられなかった．結論：角膜抵抗測定装置で得た結果は培養角膜細胞による結果と相関性がみられ，生体眼でのプロスタグランジン関連薬の角膜障害性を評価するうえで有用であった．また，いずれの方法においても，角膜障害は，キサラタン＞トラバタン＞トラバタンズ＝ルミガンであった．Objectives：Safetyof4prostaglandinderivativepreparationsforrabbitcornealepitheliumwasevaluatedinvivo,usingacornealresistancemeasuringdevice.Correlationwithcytotoxicityagainstculturedrabbitcornealcellsevaluatedinvitrowasalsoanalyzed.Methods：Culturedcellsofarabbit-derivedcornealcelllinewereexposedtotheophthalmicsolutionsXalatanR,LumiganR,TravatanzRorTravatanRfor0-60minutesandviablecellswerecounted,followedbycalculationofexposuretimecausing50％celldamage（CDT50）foreachsolution.Cornealresistance（CR）wasmeasuredat2,30and60minutesaftercompletionof3eyedropdoses（instilledatintervalsof15minutes）totheconjunctivalsacofeachrabbit.Results：CDT50was51.0minuteswithTravatanzR,50.5minuteswithLumiganR,25.3minuteswithTravatanRand11.6minuteswithXalatanR.CRratio（post-treatmentCR×100/pre-treatmentCR）was81.0％withTravatanR（30minutesafterendoftreatment）and82.0％withXalatanR（2minutesafterendoftreatment）,indicatingsignificantreductionofCRtreatmentwiththesetwopreparations（p＜0.05）.CRdidnotdecreaseaftertreatmentwithTravatanzRorLumiganR.Conclusion：Theseresultssuggestthatthecytotoxiceffectswere：XalatanRophthalmicsolution＞TravatanRophthalmicsolution＞TravatanzRophthalmicsolution＝LumiganRophthalmicsolution.Thedataoncornealresistancecorrelatedwiththedatafromculturedcornealcells,reflectingtheusefulnessofcornealresistanceasanindicatorofcornealinjurybyprostaglandinderivativesinvivo.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（11）：1581.1585,2010〕1582あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（100）はじめに一般に点眼薬には，有効性，安全性，安定性，さし心地という4つの条件が求められ，そのために主薬のほか種々の添加剤が加えられている．抗菌薬，抗ウイルス薬，抗真菌薬，非ステロイド薬，抗緑内障薬および表面麻酔薬などさまざまな点眼薬で比較的高頻度に発現する副作用である角膜上皮障害は，頻回点眼，多剤併用および長期連用ではさらにその発症頻度が高くなる．角膜上皮障害の原因として，添加剤である防腐剤が注目されている．筆者らはこれまでに，培養兎由来角膜細胞による評価法（invitro）や角膜抵抗測定装置による評価法（invivo）を用いて，種々の点眼薬の角膜上皮細胞に対する安全性を評価している1,2）．本研究では4種類のプロスタグランジン関連薬の角膜上皮への影響を，invitroおよびinvivoの実験系で評価し，薬剤により異なる原因，および評価系の相関について検討した．I実験材料1.試験薬剤つぎの点眼薬について検討した．また，これらの製剤のおもな成分については表1に示した．・キサラタンR点眼液0.005％（ファイザー）：主成分ラタノプロスト（プロスタグランジンF2a誘導体）（以下，キサラタンと略す）・トラバタンズR点眼液0.004％（日本アルコン）：主成分トラボプロスト（プロスタグランジンF2a誘導体）（以下，トラバタンズと略す）・トラバタンR点眼液（アルコン）：主成分トラボプロスト（プロスタグランジンF2a誘導体）（以下，トラバタンと略す）・ルミガン点眼液0.03％（千寿製薬）：主成分ビマトプロスト（プロスタマイド誘導体）（以下，ルミガンと略す）を用いた．2.使用動物ニュージーランド成熟白色家兎（NZW；体重3.0～3.5kg）（雄性，16羽）を本実験に使用した．動物の使用にあたり，金沢医科大学の動物使用倫理委員会の使用基準に従い，そのうえ，実験はARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmology）のガイドラインに従って，動物に負担が掛らないように，配慮して行った．3.使用細胞株細胞株は家兎由来角膜細胞（ATCCCCL60）（以下，SIRCと略す）を使用し，10％fetalbovineserum（FBS）添加Dulbecco’smodifiedEagle（DME）培地で37℃，5％CO2下で培養した．4.角膜抵抗測定装置角膜電極は湾曲凹面に関電極および不関電極を同心円状に配設し，両電極が測定時に家兎の角膜表面に接するようにした．さらに，電気抵抗計装置から関電極および不関電極間に電流を通電し，その電気抵抗を測定することで角膜の電気抵抗を測定する3）．角膜抵抗値（以下，CRと略す）の測定には図1に示した角膜抵抗測定装置（Cornealresistancedevice,CRDFukudamodel2007）を用いた．本装置は角膜CL電極（メイヨー製）とファンクション・ジェネレータ（Dagatron,Seoul,Korea），アイソレーター（BSI-2；BAKElectronics,Inc.USA），およびPowerLabシステム（ADInstruments,Australia）から構成されている．角膜CL電極はアクリル樹脂製でウサギ角〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（11）：1579.1583,2010〕Keywords：角膜抵抗，培養角膜細胞株，プロスタグランジン関連薬，角膜上皮障害，生体眼．cornealresistance,culturedcornealcellline,prostaglandinderivatives,cornealepithelialinjury,eyeinvivo.表14種のプロスタグランジン系緑内障点眼剤の組成点眼液トラバタンR点眼液0.004％トラバタンズR点眼液0.004％キサラタンR点眼液ルミガンR点眼液0.03％有効成分トラボプロスト40μg（1ml中）トラボプロスト40μg（1ml中）ラタノプロスト50μg（1ml中）ビマトプロスト300μg（1ml中）添加物ベンザルコニウム塩化物ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，トロメタノール，ホウ酸，マンニトール，pH調整剤2成分，EDTA（エチレンジアミン四酢酸）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，プロピレングリコール，ホウ酸，D-ソルビトール，塩化亜鉛，pH調整剤2成分ベンザルコニウム塩化物リン酸水素二ナトリウム，リン酸二水素ナトリウム，等張化剤ベンザルコニウム塩化物リン酸水素ナトリウム水和物，塩化ナトリウム，クエン酸水和物，塩酸，水酸化ナトリウム（101）あたらしい眼科Vol.27，No.11，20101583膜形状に対応する直径とベースカーブとを有している．湾曲凹面に設けられた関電極および不関電極の材質はいずれも金で，その外径（直径）は，それぞれ，12mm，4.8mmおよび，幅が0.8mm，0.6mmである．測定条件は交流，周波数：1,000Hz，波形：矩形波，duration：5ms，電流：±50μAで設定した．II実験方法1.培養兎由来角膜細胞による評価（invitro）SIRC（2×105cells）を10％FBS添加DME培地37℃，5％CO25日間培養後，各点眼液（200μl）を0～60分間接触後，細胞数をコールターカウンター法で測定した．薬剤非接触細胞での細胞数を100として，細胞生存率（％）を算出した．その後，各種点眼薬の50％細胞致死時間（以下，CDT50）を算出した．CDT50（分）は生存率（％）をもとにして，2次方程式の解の公式，aX2＋bX＋c＝0（≠0），X＝.b±b2－4ac/2aにより求めた．Y軸に値が50％となるときのX軸値を2次方程式から求め，これをCDT50（分）値とした．2.角膜抵抗測定法による評価（invivo）成熟白色家兎の結膜.内にキサラタン，ルミガン，トラバタンズあるいはトラバタンを15分ごと3回（1回50μl）点眼し，点眼終了2分，30分，60分後のCRを測定した．家兎を4群に分けて，1群に4眼を使用した．CRの測定法には角膜抵抗測定装置を用い，CR値（W）とCR比（％）の算出はつぎのように行った．CR（W）＝電圧（V）/電流（A）＝（mV×10.3）/100μA×10.6CR比（％）＝点眼後のCR×100/点眼前のCR3.フルオレセイン染色法による角膜障害の評価各点眼薬による角膜上皮障害の有無は点眼終了2分，30分，60分後に1％fluoresceinsodium2μlを結膜.内に点眼し，細隙灯顕微鏡下で観察した．染色の程度はAD分類5）により評価した．4.統計学的処理検定はStudent’st-testを行い，有意水準は0.05％とした．III結果1.培養兎由来角膜細胞による評価（invitro）SIRCに対する評価では，トラバタンの生存率は接触30分後まではトラバタンズとほぼ同程度の生存率を示したが，接触60分時点では50.0％にまで減少しトラバタンズに比べて有意に減少した（p＜0.05）．ルミガンでは接触時間の経過とともに，徐々に生存率は減少した．一方，キサラタンでは接触時間とともに生存率は減少し，接触8分後では17.1％にまで減少した（図2）．各種点眼薬のCDT50はトラバタンズ51.0分，ルミガン50.5分，トラバタン25.3分，キサラタン11.6分の順であった．2.角膜抵抗測定法による評価（invivo）角膜抵抗測定法によるCR比は，トラバタン81.0％（点眼終了30分後），キサラタン82.0％（点眼終了2分後）とそれぞれ有意に低下した（p＜0.05）が，その後，時間の経過とともに回復した．一方，トラバタンズではどの時点もほとんど低下はみられなかった．ルミガンにおいても，CR（％）の低Trigger（Functiongenerator）IsolatorPowerLab（current＝±50μA，frequency＝1,000Hz）ComputerContactlenselectrodes図1角膜抵抗測定装置の図0生存率（％）10203040時間（分）50607080＊＊p＜0.001：トラバタン120100806040200：トラバタンズ：キサラタン：ルミガン図2培養兎由来角膜細胞による評価（invitro）010203040506070CR（％）時間（分）140120100806040200：トラバタン：トラバタンズ：キサラタン：ルミガン図3角膜抵抗測定法による評価（invivo）1584あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（102）下はみられず，むしろ，わずかに高い値を示す傾向がみられた（図3）．3.フルオレセイン染色法による角膜障害の評価（invivo）フルオレセイン染色によるAD分類では，トラバタンはA1D1（点眼終了30分後）（4眼中4眼），キサラタンはA1D2（点眼終了2分後）（4眼中4眼）であった．トラバタンズとルミガンでは各時点においてもA0D0（各4眼中4眼）であった（図4）．IV考按今回，実験に用いた角膜抵抗測定装置は，これまでにいくつかの改良を加えて，得られる値の信頼性，生体に対する安全性を確立した筆者らが開発した装置であり，薬剤の角膜上皮障害の評価方法として有用性が高いことを報告している3）．すなわち，本測定装置は，家兎眼の角膜上に電極を埋め込んだコンタクトレンズを装着して，交流電流を通電し，コンピュータ上に電圧を表示させ，電流と電圧の関係から抵抗値を算出するシステムで，invitroの実験系ではみることのできない角膜上皮バリア機能の回復過程を家兎眼でリアルタイムに定量的に確認することができる．培養角膜細胞（invitro）による実験系はSIRC細胞に各点眼薬を接触し，経時的に細胞数を測定して，CDT50（分）を算出するもので，筆者らはこれまでに，数多くの点眼薬の安全性の評価にこの方法を用いて行ってきた．この評価方法は測定感度が高いこと，データの再現性が良いこと，実験操作が簡便であることなどの長所を有する．一方，短所としては単層細胞系で生体眼での生理学的な現象と異なる環境であるため，得られたデータがどの程度，生体眼での影響を反映しているか不明の点がある．そこで，これらの異なる評価方法により，4種のプロスタグランジン系関連薬の角膜上皮細胞への影響の比較と合わせて，評価方法から得られた結果の相関性を明らかにする目的で検討を行った．その結果，CR比では，ベンザルコニウム塩化物（以下，BAKと略す）0.015％含有のトラバタンは81.0％（点眼終了30分後），BAK0.02％含有のキサラタンは82.0％（点眼終了2分後）にそれぞれ低下したが，時間の経過とともにいずれもCR値は上昇した．BAKを含まないトラバタンズとBAK0.005％含有のルミガンはいずれの時点でもCR比の低下はほとんどみられなかった．ルミガンでは点眼前に比べて，点眼後はわずかではあるが高値を示す傾向がみられたが，この原因は点眼薬中の添加剤であるクエン酸などが影響しているのではないかと考えている．このときの角膜上皮のフルオレセイン染色による評価ではキサラタンが最も障害がA1D2A0D0A0D0A1D1トラバタントラバタンズルミガン点眼終了30分後点眼終了30分後点眼終了30分後点眼終了2分後キサラタン図4フルオレセイン染色法による角膜障害例（103）あたらしい眼科Vol.27，No.11，20101585強く，ついでトラバタンで，トラバタンズとルミガンでは明らかな障害はみられず，角膜抵抗の結果と一致した．Invitro試験としてのSIRC細胞の60分接触の生存率では，トラバタンがトラバタンズに比べ有意に低下した（p＜0.05％）．また，CDT50についてもトラバタンズとルミガンに比べてキサラタンとトラバタンは短く，細胞障害を起こしやすい傾向がみられた．このようなトラバタンとトラバタンズの角膜障害の差は，おそらくBAKの有無によるものと考えられ，過去にもいくつかの報告がある5,6）．BAKを含まないトラバタンズでもinvitroの実験では細胞生存率が薬剤接触直後から30～40％の減少がみられたが，この原因は細胞死によるものではなく，点眼薬中のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40による細胞間の密着性の低下による細胞脱落が原因である可能性が高いと考えている．しかしinvivoの実験においては，涙液の存在のために角膜上のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40が希釈され，角膜上皮の構造が密で重層であることから影響が生じにくかったものと思われる．角膜上皮バリア機能の回復に関しては，Wolasinの家兎角膜細胞での報告によると，最表層1層のみの.離なら健常レベルに回復するまで1時間程度で，この程度では蛋白合成阻害の影響を受けない．一方，翼状細胞までの.離では健常レベルに回復するまでに8～10時間を要し，この過程では蛋白合成阻害の影響を受けることが知られている7）．今回の実験で得られた生体眼でのCR値はおそらく，角膜上皮障害の程度と回復状態を反映していると考える．以上の結果はinvitro（培養兎由来角膜細胞）とinvivo（角膜抵抗測定およびフルオレセイン染色）による評価法はよく相関していることを示したものと考えてよい．したがって，生理的条件が異なるため培養細胞での細胞障害の結果をそのまま臨床評価に結び付けることはできないが，培養細胞の評価は生体眼での成績を予測する有用な検討方法と考える．本研究から4種類のプロスタグランジン関連薬で角膜上皮への影響に差があることを改めて確認できた．ただし，正常な角膜に対する1日1回の単剤点眼であれば，BAK含有点眼薬であっても，細胞障害をひき起こすことはほとんどないと考えられる．しかし，角膜が脆弱なあるいは他の点眼薬の併用が必要な緑内障患者では，できる限り角膜障害の少ない点眼薬を使用したい．最近，配合剤が点眼コンプライアンスの向上および角膜上皮障害の低減の面から注目されているが，最適な薬剤の選択には十分な眼圧下降効果を有することも考慮することが重要である．文献1）福田正道，佐々木洋：オフロキサシン点眼薬とマレイン酸チモロール点眼薬の培養角膜細胞に対する影響と家兎眼内移行動態．あたらしい眼科26：977-981,20092）福田正道，佐々木洋：ニューキノロン系抗菌点眼薬と非ステロイド抗炎症点眼薬の培養家兎由来角膜細胞に対する影響．あたらしい眼科26：399-403,20093）福田正道，山本佳代，高橋信夫ほか：角膜抵抗測定装置による角膜障害の定量化の検討．あたらしい眼科24：521-525,20074）MiyataK,AmanoS,SawaMetal：Anovelgradingmethodforsuperficialpunctatekeratopathymagnitudeanditscorrelationwithcornealepithelialpermeability.ArchOphthalmol121：1537-1539,20035）PellinenP,LokkilaJ：Cornealpenetrationintorabbitaqueoushumoriscomparablebetweenpreservedandpreservative-freetafluprost.OphthalmicResearch4：118-122,20096）YeeRW,NorcomEG,ZhaoXC：Comparisonoftherelativetoxicityoftravoprost0.004％withoutbenzalkoniumchlorideandlatanoprost0.005％inanimmortalizedhumancorneaepithelialcellculturesystem.AdvTher23：511-518,20067）WolosinJM：Regenerationofresistanceandiontransportinrabbitcornealepitheliumafterinducedsurfacecellexfoliation.JMembrBiol104：45-55,1988＊＊＊