《原著》あたらしい眼科31（3）：409.413，2014cヒト重層化培養角膜上皮モデルを用いた眼科用製剤の眼刺激性に関する新規評価手法の開発髙田洋平＊1櫻井俊輔＊1宮本幸治＊1坂元伸行＊1宮崎剛＊2山田昌和＊3＊1日油株式会社ライフサイエンス事業部ライフサイエンス研究所＊2日油株式会社ライフサイエンス事業部ヘルスケア部＊3杏林大学医学部眼科学教室NewMethodofEvaluatingEyeCareSolutionToxicityUsing3-DimensionalModelofHumanCornealEpitheliumYoheiTakada1）,ShunsukeSakurai1）,KojiMiyamoto1）,NobuyukiSakamoto1）,TsuyoshiMiyazaki2）MasakazuYamada3）and1）LifeScienceResearchLaboratory,LifeScienceProductsDivision,NOFCORPORATION,2）NOFCORPORATION,3）KyorinEyeCenter,KyorinUniversitySchoolofMedicineLifeScienceProductsDivision,目的：眼刺激性評価試験では家兎眼や培養細胞が用いられるが，被験物質の角膜障害性について，invitroで形態学的観点から評価する手法はほとんどなかった．本研究ではヒト重層化培養角膜上皮モデル（角膜モデル）に市販点眼剤を接触させ，その表面状態を走査型電子顕微鏡（SEM）で観察することで角膜への影響を評価した．方法：各点眼剤を角膜モデルに接触させ，表面のSEM観察を行って障害の程度をスコア化した．また，ウサギ培養角膜上皮細胞での毒性試験を行い，各点眼剤のIC50とスコアとの相関関係を調べた．結果：SEM観察の結果，ホウ酸緩衝液やベンザルコニウム塩化物，クロルヘキシジングルコン酸塩，ソルビン酸カリウムを含む点眼剤で細胞障害の進行が観察できた．各点眼剤の障害スコアとIC50は高い相関関係を示した．結論：本手法により各点眼剤の角膜障害性を形態学的に評価可能となり，眼科用製剤の新たな評価手法として有用であることが示唆された．Purpose：Todevelopanewmethodofevaluatingoculartoxicityusinga3-dimensionalmodelofthehumancornealepithelium.Methods：Afterexposingcornealmodelstoseveralcommercialeyedrops,themodels’surfacedamagelevelswerescoredbyscanningelectronmicroscope.TheIC50valuesofthesamesampleswerecalculatedusingtherabbitcornealcelltoxicitytest,whichisgenerallyusedasanalternativetotheinvivoanimaltest.CorrelationbetweencornealmodeldamagescoresandIC50valueswereevaluated.Results：Severaleyedropscontainingboricbufferorpreservatives（benzalkoniumchlorideorchlorhexidinehydrochloride）showedhighdamageleveloncornealmodels,andhighcytotoxicity.TherewassignificantcorrelationbetweencornealmodeldamagescoresandIC50values.Conclusion：Theseresultssuggestthatthisnewevaluationmethodusingahumancornealmodelisappropriatefortestingtheirritancyofeyecaresolutions.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（3）：409.413,2014〕Keywords：角膜障害，培養角膜上皮，走査型電子顕微鏡，点眼剤，防腐剤．cornealdisorder,culturedcornealepithelialcells,scanningelectronmicroscope,eyedrops,preservatives.はじめに点眼薬やコンタクトレンズケア用品など眼科用製剤のヒトの眼に対する刺激性を評価・推測する手法としては，家兎眼を用いたDraize試験1）が一般的な試験として広く行われている．ただし，Draize試験では動物の使用が必須であるため，試験実施に要する費用や動物愛護の観点から，多検体の評価には不向きである．これまでにDraize試験の代替法探索が行われており，たとえば既知の眼刺激性化合物に対するDraize試験の結果と，ウサギ角膜上皮由来の培養細胞（以下，SIRC細胞）を用い〔別刷請求先〕髙田洋平：〒300-2635茨城県つくば市東光台5-10日油株式会社ライフサイエンス事業部ライフサイエンス研究所Reprintrequests：YoheiTakada,LifeScienceResearchLaboratory,LifeScienceProductsDivision,NOFCORPORATION,10,Tokodai5-chome,Tsukuba,Ibaraki300-2635,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（105）409 た細胞毒性試験の結果が相関関係を示すことが報告2）されている．培養細胞を用いた毒性試験はDraize試験と比較して簡便・迅速に多検体処理が可能であるため，多数の化合物や処方に対してスクリーニング評価する際に非常に有効である．一方で，細胞毒性試験は単純に細胞の生存率を評価対象とするため，被験物質が細胞毒性を示す作用機序の違いを評価することは困難である．また，角膜上皮は生体では層構造を持つ重層扁平上皮であり，表層細胞はバリア機能を有するのに対し，通常の培養上皮細胞は単層構造であるなど異なる性質を有しており，実際の生体の眼組織に対する影響の評価法として問題点が残されている．そこで本研究では，ヒト正常角膜上皮由来の培養細胞をカップ内に重層培養することで，生体の角膜上皮に近い構造を構築したヒト重層化培養角膜上皮モデル（以下，角膜モデルと略す）を用い，被験物質曝露後の細胞表面の状態を走査型電子顕微鏡（SEM）で観察する方法を試みた．点眼剤が角膜に及ぼす影響について形態学的な観点から評価する新たな手法と考えられるので報告する．I実験対象ならびに方法1.対象角膜モデルはラボサイト角膜モデル（（（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）を購入して使用し，SIRC細胞（RCBNo.1835）は（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手して使用した．表1には使用した各市販点眼剤とその概要を示した．2.方法a.各点眼剤を処理した角膜モデル表面のSEM観察と障害スコア化角膜モデルを未開封の状態で25℃にて3日間静置後，24ウェルプレートに角膜モデルを移し，0.5ml/wellとなるようにアッセイ培地（（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）を添加して37℃にて4日間培養した．健常人では涙液がターンオーバーし，涙液中の薬物濃度は5分間で約50％となることが報告3）されている．このことを参考に，本研究では，投与条件として，表2に示した各点眼剤を生理食塩水にて2倍希釈した液0.3mlを角膜モデルに5分間接触させた．対照には生理食塩水を用いた．各点眼剤または生理食塩水を除去し，4℃に冷却した組織固定液（1％グルタルアルデヒドおよび2％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液）0.3mlを角膜モデルに添加し，さらに4℃にて30分間静置した．組織固定液を除去後，角膜モデルを培養カップ底面より切り出し，新しい24ウェルプレートに移した．その後，角膜モデルに4％四酸化オスミウム液を0.3ml添加し，密封して4℃にて30分間静置した．4％四酸化オスミウム液を回収し，0.3mlのリン酸緩衝液中に3分間静置する洗浄操作を2回行った．続いて角膜モデルを50，70，80，90，95％エタノール0.3mlにそれぞれ5分間1回ずつ浸漬し，99.5％エタノールにて5分間3回の浸漬を行った．さらに，エタノールとtブタノールの等量混合液0.3mlに5分間浸漬した後に，tブタノールに5分間4回浸漬してから角膜モデルが浸る程度のt-ブタノールを加え，4℃にて凝固させた．このサンプルを減圧下で凍結乾燥した．得られたサンプルを導電性テープで観察台に貼り付け，イオンスパッタ装置（（株）日立ハイテクノロジーズ製，表1試験に用いた市販点眼剤市販点眼剤防腐剤含有成分（緩衝剤など）リン酸水素Na，リン酸二水素Na，NaCl，KCl，ヒプロメロース，2-メタクリロイルオキ製品A塩酸ポリヘキサニドシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体液製品B─ホウ酸，NaCl，KCl，pH調節剤ホウ酸，エデト酸Na，コンドロイチン硫酸エステルNa，NaCl，KCl，ヒプロメロース，製品Cソルビン酸KpH調整剤ホウ酸，ホウ砂，エデト酸Na，コンドロイチン硫酸エステルNa，NaCl，KCl，ヒプロメロ製品D─ース，ブドウ糖，ヒアルロン酸Na，ポリソルベート80，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー），pH調節剤ホウ酸，ホウ砂，エデト酸Na，NaCl，L-アスパラギン酸K，タウリン，シクロデキストリ製品E塩化ベンザルコニウムン製品Fクロルヘキシジングルコン酸ホウ酸，ホウ砂，エデト酸Na，NaCl，KCl，ブドウ糖，ポリソルベート80，ヒドロキシエチルセルロース製品G塩化ベンザルコニウムホウ酸，ホウ砂，エデト酸Na，塩酸テトラヒドロゾリン，pH調整剤，等張化剤410あたらしい眼科Vol.31，No.3，2014（106） E-1010形日立イオンスパッタ）にて金蒸着を15mAにて15秒間行い，SEM用サンプルを作製した．これをSEM（（株）日立ハイテクノロジーズ製，S-3000N形走査電子顕微鏡標準ステージ付属）にセットし，加速電圧5kV，100.1,000倍で観察した．各サンプルの角膜表層の状態について，100倍にて取得した画像の細胞の表面構造や細胞間結合に損傷がない状態をスコア1，最表層部分から一部の細胞が.離し軽度の障害が生じている状態をスコア2，細胞間結合が崩壊して2層目以降の細胞が.離している状態をスコア3としてスコア化した．各スコアの代表的なSEM観察画像（傾斜角30°，観察倍率1,000倍）を図1に示した．なお，各サンプルは2つの角膜モデルで試験を実施し，スコアの判定は各試験で傾斜角をつけずに取得した倍率100倍の画像の中央付近10カ所にて実施した．b.各点眼剤のSIRC細胞に対する細胞毒性試験試験はISO10993記載の方法4）を参考に実施した．SIRC細胞を96wellプレートに1×104cells/wellとなるように播種し，10％のウシ胎児血清と各種抗生物質（100unit/mlペニシリンG，0.1mg/ml硫酸ストレプトマイシン，0.25ug/mlアンホテリシンB）を含むDulbecco’smodifiedEagle’smedium（以下，培地）にて37℃で24時間培養した．培地を除去し，表2に示した各点眼剤または生理食塩水を培地にて多段階希釈した液を0.2ml/wellずつ分注してSIRC細胞に接触させ，さらに37℃で24時間培養した．その後，希釈液を除去し，ニュートラルレッドを0.05mg/mlとなるように培地で希釈した液を0.1ml/wellずつ分注して細胞に接触させ，37℃で3時間培養することで生存する細胞を染色した．リン酸緩衝液を0.1ml/wellずつ分注して各ウェルを洗浄し，色素抽出液（50％エタノールおよび1％酢酸含有水溶液）を0.1ml/wellずつ分注して5分間振盪し，その後吸光度（540nm）を測定した．得られた吸光度から各点眼剤または生理食塩水の細胞増殖に対する半阻害濃度（IC50）を算出した．なお，試験は各濃度ともn＝3で実施した．c.障害スコアとIC50の相関関係評価各点眼剤と生理食塩水の角膜モデルに対する障害スコアをX軸に，SIRC細胞に対するIC50をY軸にプロットして相関係数と回帰式を求め，障害スコアとIC50に相関関係が認められるか検討した．II結果1.各被験物質の角膜モデルへの影響各点眼剤または生理食塩水で処理した角膜モデルの代表的なSEM観察画像（傾斜角30°，観察倍率1,000倍）を図2に示す．また，角膜モデルに対する障害性をスコア化した結果を表2に示した（n＝20）．生理食塩水で処理した角膜モデルには最表層の細胞構造や細胞間結合に損傷が認められなかった（図2A）．一方で，各点眼剤で処理した場合では，使用している緩衝系の種類や防腐剤の有無によって角膜モデル表面の状態が大きく異なることがわかった．具体的には，製剤の緩衝系としてホウ酸緩衝液を使用している点眼剤（図2C.H）のほうが，リン酸緩衝液を使用している点眼剤（図2B）よりも角膜モデル表面の細胞の損傷が引き起こされる傾向が認められた．さらに，防腐剤としてベンザルコニウム塩化物やクロルヘキシジングルコン酸塩，ソルビン酸カリウムを含有する点眼剤（図2D，F.H）は，細胞間結合の崩壊やそれに伴う上層部分の細胞の.離が生じており，塩酸ポリヘキサニドが含まれている点眼剤（図2B）や防腐剤を含まない点眼剤（図2C，E）と比較して表2各被験物質の角膜モデルに対する障害スコア被験物質障害スコア＊生理食塩水1.3±0.3製品A1.6±0.4製品B2.3±0.3製品C2.5±0.5製品D2.1±0.6製品E2.5±0.5製品F2.8±0.4製品G2.8±0.3＊n＝20の結果の平均値±標準偏差を記載した．最表層最表層２層目(A)(B)20um20um２層目３層目(C)20um図1角膜モデルの障害スコア代表例（A）スコア1，（B）スコア2，（C）スコア3．（107）あたらしい眼科Vol.31，No.3，2014411 図2各点眼剤を処理した角膜モデル最表層のSEM観察（A）生理食塩水，（B）製品A，（C）製品B，（D）製品C，（E）製品D，（F）製品E，（G）製品F，（H）製品G．20um(A)(B)(C)(H)(D)(E)(F)(G)20um20um20um20um20um20um20um20um(A)(B)(C)(H)(D)(E)(F)(G)20um20um20um20um20um20um20um表3各被験物質のSIRC細胞に対する細胞毒性1被験物質IC50（ml/ml）＊生理食塩水0.86製品A0.67製品B0.59製品C0.34製品D0.31製品E0.30製品F0.17SIRCIC50（mL/mL）0.80.60.40.2製品G0.06＊n＝3の結果の平均値を記載した．角膜モデルへの障害スコアが高いことがわかった．2.各被験物質の細胞毒性試験各点眼剤または生理食塩水のSIRC細胞に対するIC50を表3に示した（n＝3）．IC50は数値が低いほど被験物質の細胞毒性作用が高いことを示しており，角膜モデルでの評価結果と同様に，ホウ酸緩衝液とベンザルコニウム塩化物やクロルヘキシジングルコン酸塩，ソルビン酸カリウムを含有する点眼剤の細胞毒性が高くなる傾向であった．防腐剤を含まない製品Bと製品Dは，角膜モデルでの検討では同程度の障害スコアを示したが，SIRC細胞に対するIC50では製品Dのほうが毒性が高い結果となった．3.角膜モデルに対する障害スコアとSIRC細胞に対するIC50の相関性評価図3に障害スコアとIC50をプロットした結果を示した．プロットした点から算出した回帰式はy＝.0.4463x＋1.4053となり，相関係数は0.9136となった．412あたらしい眼科Vol.31，No.3，201400123角膜モデル障害スコア図3障害スコアとIC50の相関関係III考察眼科用製剤を開発する際には，多数の開発候補のなかから安定性や安全性を考慮して製品化候補を選定することが必要となる．すべての開発候補に対して動物試験を実施することは，費用の面からも動物愛護の観点からも現実的に困難である．一方で，一般的に行われている細胞毒性試験は簡便でハイスループットに被験物質の眼刺激性を評価する試験方法であるが，試験結果から得られる情報が限定的であり，点眼剤などの眼科用製剤を実際に使用した場合に角膜に対してどのような影響を及ぼすのかを推測することは困難であった．本研究では，従来の細胞試験よりもより生体組織に近い試験材料である角膜モデルを用いて，形態学的な観点から各種の点眼剤の角膜に対する影響を評価・予測する手法を検討した．図3に示した結果から，各点眼剤の角膜モデルに対する障害スコアが，眼刺激性試験の代替試験法として広く実施されてきたSIRC細胞毒性試験のIC50とp＜0.01で有意に負の相関を示すことがわかった．今回報告した試験手法を用いるこ（108） とで，複数の開発候補のなかからヒト角膜に対する障害性が低いものを推測・選定することが可能となり，製品開発過程で必要となる動物試験の実施数削減に貢献できると考えられる．今回評価を実施した各点眼剤の角膜モデルに対する結果（図2，表3）については，ホウ酸緩衝液を含む6製品のほうが，リン酸緩衝液を含む製品よりも角膜モデルへの障害が大きかったことから，ホウ酸緩衝液に起因する角膜表面構造の変化が生じていることが示唆された．眼科用製剤に含まれるホウ酸緩衝液の影響については，ソフトコンタクトレンズ用のマルチパーパスソリューション（MPS）において，ホウ酸緩衝液含有製剤がヒト角膜上皮細胞の膜結合型ムチンの発現を抑制すること5），また臨床試験においてもホウ酸緩衝液とポリクォッドが含有されているMPSで角膜上のムチンが減少することが報告6,7）されており，今回の観察結果についてもホウ酸緩衝液の角膜モデル表面に存在するムチン層への影響が考えられた．また，防腐剤を含有する点眼剤5製品の結果を比較したところ，塩酸ポリヘキサニドを含む点眼剤以外は角膜モデルの障害スコアが2以上となり障害が強くなった．塩酸ポリヘキサニドを含む点眼剤の角膜モデルへの影響がほとんど認められなかった理由については，塩酸ポリヘキサニドの安全性が高い8）こと，および，これに添加の2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体液による細胞毒性抑制効果9）によるものと考えられる．各点眼剤のSIRC細胞に対するIC50については，製品Bと製品DではIC50に差異が認められた（表4）が，一方で角膜モデルでの障害スコアが同等であったことから，SIRC細胞を用いた細胞毒性試験では，製剤の眼に対する毒性・刺激性が過大評価される可能性が示唆された．本研究の結果から，3次元角膜モデルを用いた形態学的な観察により，より臨床試験に近い条件で，眼科用製剤のヒト角膜への影響を推測することが可能であることが示唆された．今回検討した新しい試験法は，眼科用製剤の安全性および有用性評価において有効な手法となることが期待される．文献1）DraizeJH,WoodardG,CalveryHO：Methodsforthestudyofirritationandtoxicityofsubstancesappliedtopicallytotheskinandmucousmembranes.JPharmacolExpTher82：377-390,19442）TorishimaH,YamamotoR,WatanabeM：Neutralredassayusingnormalrabbitcornealepithelialcellsgrowninserum-freemediumasanalternativetotheDraizeirritationtest.AATEX3：29-36,19953）清水章代，横井則彦，西田幸二ほか：フロオロフォトメトリーを用いた健常者の涙液量，涙液turnoverrateの測定．日眼会誌97：1047-1052,19934）国際規格医療機器の生物学的評価-第5部：インビトロ細胞毒性試験附属書Aニュートラルレッド取り込み（NRU）細胞毒性試験ISO10993-5,20095）TchedreKT,ImayasuM,HoriYetal：Assessmentofeffectsofmultipurposecontactlenscaresolutionsonhumancornealepithelialcells.EyeContactLens37：328330,20116）ImayasuM,ShiraishiA,OhashiYetal：Effectsofmultipurposesolutionsoncornealepithelialtightjunctions.EyeContactLens34：50-55,20087）福井正樹，羽藤晋，谷井啓一ほか：MultipurposeSolutionが眼表面ムチンに及ぼす影響．日コレ誌51：247-250,20098）MullerG,KramerA：Biocompatibilityindexofantisepticagentsbyparallelassessmentofantimicrobialactivityandcellularcytotoxicity.JAntimicrobChemother61：12811287,20089）小林-安藤亮太，土田衛，猪又潔ほか：MPCポリマーによるポリヘキサメチレンビグアニド（PHMB）製剤の細胞毒性低減効果．日コレ誌52：265-269,2010＊＊＊（109）あたらしい眼科Vol.31，No.3，2014413