《原著》あたらしい眼科34（10）：1450～1454，2017スリットランプ型スペキュラーマイクロスコープを用いた角膜内皮の評価名畑浩昌＊1秋山陽一＊1重安千花＊1新崎賢一＊2山田昌和＊1平形明人＊1＊1杏林大学医学部眼科学教室＊2タカギセイコー株式会社CCornealEndothelialAnalysisbyEndothelialBiomicroscopeAppliedtoSlit-lampHiromasaNabata1）,YouichiAkiyama1）,ChikaShigeyasu1）,KenichiShinzaki2）,MasakazuYamada1）andAkitoHirakata1）1）DepartmentofOphthalmology,KyorinUniversitySchoolofMedicine,2）TakagiSeikoCo.,Ltd.目的：細隙灯顕微鏡に接続して用いる角膜内皮観察，解析装置を用い，従来型と比較した．方法：対象は正常者11例C22眼．スリットランプはCTakagi700GL，新しい角膜内皮観察装置としてCEndoKer（ともにタカギセイコー社）を使用した．角膜内皮をスリットランプの鏡面法で観察してコンピュータで画像を拡大，解析を行う方式を導入している．従来型はCNSP9900II（コーナンメディカル）を使用した．両機種で角膜中央の内皮細胞撮影をC3回行い，級内相関係数（ICC）を算出した．また，細胞密度（CD），細胞面積の変動係数（CV），六角形細胞率（6A）のC3回測定の平均値を用いて，機種間の差と相関を分析した．結果：CDのCICCはCEndoKerでC0.688，NSP9900CIIでC0.864であった．両機種間においてCCD，6Aに有意差はなかったが，CVはCNSP9900CIIがCEndoKerより有意に高い値を示した（p＜0.001）．両機種におけるCCDは強い相関を示した（r＝0.740,Cp＜0.001）．結論：EndoKerは従来型とほぼ同等の角膜内皮解析結果が得られた．手技に習熟する必要があるがスリットランプでの観察中に定量的評価が可能であり，臨床的メリットがあると考えられた．EndoKer（TakagiSeiko）,anewdevice,wasappliedtotheTakagi700GLslit-lampandtheresultswerecom.paredCwithCtheCconventionalCendothelialCmicroscopeCNSP9900CII（KonanCMedical）.C22CeyesCofC11CnormalCsubjectsCwereincludedinthestudy.ThecenterofthecorneawasconsecutivelymeasuredthreetimeseachwiththetwoinstrumentsandICCwascalculated.TheaverageofthethreemeasurementsofCD,CVand6Awasthencalculat.ed.CTheCdi.erencesCandCtheCcorrelationCbetweenCtheCdevicesCwereCanalyzed.CICCCofCCDCwasC0.688CwithCEndoKer,C0.864withNSP9900II.Therewerenostatisticaldi.erencesbetweenCDand6A,howeverCVshowedstatisticallyhigherratewithNSP9900II（p＜0.001）.CDshowedhighcorrelationbetweenthetwoinstruments（r＝0.740,Cp＜0.001）.CEndoKerCshowedCsatisfactoryCresultsCcomparedCtoCtheCconventionalCmicroscope.CAlthoughCtheCexaminerCneedstobeaccustomedtotheprocedure,quantitativeassessmentduringtheslit-lampexaminationseemstoo.erclinicaladvantages.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）34（10）：1450～1454,C2017〕Keywords：精度，角膜内皮細胞，細隙灯顕微鏡，スペキュラーマイクロスコープ．accuracy,cornealendothelium,slit-lamp,specularmicroscope.Cはじめに1918年にCVogtにより鏡面反射法による角膜内皮細胞の観察が報告され，1968年にCMauriceがスペキュラーマイクロスコープを試作して以来，角膜内皮細胞の研究は飛躍的に進歩を遂げている1～3）．1974年のCBronらの接触型から非接触型のスペキュラーマイクロスコープの研究をもとに4），1990年代に各メーカーが機器の開発，臨床応用を行い，さらに撮影，解析精度の改良や自動化が進み，今日のように日常診療で用いられる検査機器となった．スペキュラーマイクロスコープの撮影原理は，観察光を内〔別刷請求先〕名畑浩昌：〒181-8611東京都三鷹市新川C6-20-2杏林大学医学部眼科学教室Reprintrequests：HiromasaNabata,DepartmentofOphthalmology,KyorinUniversitySchoolofMedicine,6-20-2Shinkawa,Mitaka,Tokyo181-8611,JAPAN1450（112）皮細胞層に反射させて得られた像をとらえる鏡面反射法である．接触型は，角膜表面に対物コーンレンズを接触させて撮影を行うため広範囲で明瞭な画像を得ることができるが，感染や角膜上皮障害を生じるリスクがあり，また撮影に熟練が必要であり，現在は臨床ではほとんど用いられなくなっている．非接触型は，非侵襲的に自動で撮影，解析が行われるものが多いが，空気と角膜表面の鏡面反射が高度であるため撮影範囲が狭く，測定困難例に対してはマニュアル操作を行う必要がある5,6）．最近，新しいコンセプトのスペキュラーマイクロスコープとして，スリットランプに接続して用いる角膜内皮観察・解析装置が開発された（EndoKer，タカギセイコー）．従来のDigitalCameraTD-10（タカギセイコー）を用い，鏡面反射の原理を用いて細隙灯顕微鏡で角膜内皮細胞を観察・撮影し，コンピューターを介してデジタル画像に変換，解析を行う新しい方式を導入した機器である．また，角膜内皮を解析した結果は，既存の画像ファイリングシステム（ImageCFil.ingCSoftwareCEyeCAM，タカギセイコー）に症例ごとに保存，閲覧することができる．モデル眼および正常者を対象とした開発過程における報告では，従来の非接触型スペキュラーマイクロスコープと比較を行い，その精度は確認されているが7,8），わが国における日本人に対する精度や有用性は報告されていない．今回，日本人の正常者を対象としてCEndoKerによる角膜内皮の生体観察を行い，従来型スペキュラーマイクロスコープと測定パラメータを比較検討したので報告する．CI対象および方法屈折異常以外の眼疾患のない日本人正常ボランティアC11例C22眼（男性C5例，女性C6例），年齢は平均C27.2C±2.9歳（23～31歳）を対象とした．内眼手術歴や屈折矯正手術歴を有する者は対象から除外した．すべての対象者から，研究参加に対する文書によるインフォームド・コンセントを得た．角膜内皮をC2種類のスペキュラーマイクロスコープで観察し，解析を行った．新しい角膜内皮観察・解析装置としてEndoKerをスリットランプTakagi700GL（タカギセイコー）に接続して使用した．通常のスリット観察像に画像解析を加えた非侵襲的な方法である．スリット光で鏡面反射を用いて角膜内皮をC40倍で観察時にモニターに画像を投影し，コンピュータを介して倍率を拡大し，デジタル変換した角膜内皮像を得た後に，画像解析を行うものである（図1）．得られた角膜内皮像を，マニュアルで解析対象範囲を四角く囲み，設図1新しい角膜内皮観察・解析装置EndoKerで角膜内皮細胞を観察している様子図2EndoKerの自動解析結果の画像図3NSP9900IIの自動解析結果の画像定を行うと，解析対象の角膜内皮像とともに，自動解析結果が表示される（図2）．定量的解析に用いられる各種パラメータは一般的な従来の機種とほぼ同等であり，細胞密度（celldensity：CD,Ccells/mmC2），細胞面積の変動係数（coe.cientvariationCinCcellCsize：CV,％），六角形細胞率（relativeCfre.quencyCofChexagonalCcell：6A,％），解析面積（mmC2），観測細胞数（個），平均細胞面積と標準偏差（.mC2），最大細胞面積（.mC2），最小細胞面積（.mC2）である．従来型は全自動で角膜内皮細胞の撮影，解析を行う機器である非接触型のスペキュラーマイクロスコープCNSP9900CII（コーナンメディカル）を使用した（図3）．対象者は，同日に両機種で各眼の角膜中央の内皮細胞撮影をCNSP9900II，EndoKerの順に同一検者によりC3回ずつ行い，各種パラメータを測定した．各機種の再現性をみるためにCCD測定値の級内相関係数（1,1）を算出した．またCCD，CV，6AのC3回測定の平均値を用いて，機種間の差をCWil.coxon符号順位和検定，相関はCSpearman順位相関係数を用いて分析した．CD測定値の精度比較をCBland-Altmanplotを用い，測定値間の一致の程度を分析した．すべての統計学的解析において，有意水準をp＜0.05とした．CII結果EndoKerは解析対象範囲をマニュアルで設定したうえでの自動解析であり，今回は全症例において解析範囲を一定にした．既報に基づき角膜内皮細胞数が正常な本対象者において観測細胞数がC100個程度となるように9），モニター画面上，縦C50CmmC×横C20Cmmの範囲を解析対象範囲とした．Endo.Kerの観測細胞数はC101.5C±7.0（平均C±標準偏差）であった．NSP9900CIIは全自動測定とし，観測細胞数はC130.6C±33.1であった．両機種によるCCDの全測定結果を図4に示す．角膜内皮細胞密度（cells/mm2）4,0003,5003,0002,5002,000症例別測定値（n＝22）図4両機種による細胞密度（cells/mm2）の全測定結果●CEndoKer，○CNSP9900CIIの測定値を示す．EndoKerでC2,836.7C±98.4（平均C±標準偏差，範囲：2,413.3～3,106.7），NSP9900CIIでC2,804.8C±80.5（2,208.7～3,426.7）であり，両機種間に有意差はなかったが（p＝0.439），NSP9900IIはCEndoKerの測定結果と比較して，測定幅が大きかった．EndoKerでC2,836.7C±98.4（範囲：2,413.3～3,106.7），NSP9900CIIでC2,804.8C±80.5（2,208.7～3,426.7）であり，両機種間に有意差はなかったが（p＝0.439），NSP9900IIはEndoKerの測定結果と比較して，測定幅が大きかった．C1.CD測定値の再現性CD測定値の級内相関係数（1,1）はCEndoKerでC0.688，NSP9900IIでC0.864であり，NSP9900IIの再現性はやや.値を示した．C2.CD，CV，6A測定値の機種間の差CD測定値はCEndoKerでC2,836.7C±98.4，NSP9900CIIでC2,804.8±80.5であり，両機種間に有意差はなかった（p＝0.439）．CV測定値CEndoKerでC28.9C±4.3，NSP9900CIIでC46.1±3.0であり，NSP9900CIIがCEndoKerより有意に高値を示し（p＜0.001），またC6A測定値はCEndoKerでC45.0C±6.1，NSP9900CIIでC44.3C±5.0であり，両機種間に有意差はみられなかった（p＝0.439）（表1）．C3.CD，CV，6A測定値の相関両機種におけるCCD測定値の相関係数はCr＝0.740（p＜0.001）であり，強い相関を示した．CV測定値（r＝0.172,Cp＝0.445）とC6A測定値（r＝0.219,Cp＜0.329）には有意な相関はみられなかった．C4.CD測定値の精度比較Bland-AltmanCplotによるCCD測定値の差（NSP9900CII.EndoKer）では，両機種によるCCD測定値の平均C2,800Ccells/Cmm2付近を境として，CDの減少および増加に伴い両機種の差が開く結果となり，比例誤差を示した（図5）．表1測定値の機種間の差EndoKerCNSP9900IIC（mean±SD）（meanC±SD）pvalueCD（cells/mmC2）C2,836.7C±98.4C2,804.8±80.5C0.439CCVC28.9±4.3C46.1±3.0＜C0.001＊＊＊6A（％）C45.0±6.1C44.3±5.0C0.439両機種間においてCD，6Aに有意差はなく（p＝0.439,Cp＝0.439），CVはCNSP9900CIIがCEndoKerより有意に高値を示した（p＜0.001）．CD：cellCdensity,CCV：coe.cientCvariationCinCcellCsize,C6A：relativefrequencyofhexagonalcell,SD：standarddeviation.＊＊＊p＜0.001,Wilcoxonsigned-ranktestCIII考察スリットランプに接続して用いる新しいスペキュラーマイクロスコープCEndoKerの評価を日本人の正常者を対象として行った．EndoKerと従来型の非接触型スペキュラーマイクロスコープCNSP9900CIIとの比較では，ほぼ同等の角膜内皮解析結果が得られた．本研究の結果においてCCD測定値の級内相関係数は，両機器とも測定機器として再現性は十分であったが，NSP9900IIがより高い値を示した．また，両機種間でCCD，6A測定値に有意差はなかったが，CV値はCNSP9900IIがCEndoKerより有意に.値を示した．また，両者の測定値はCCDのみに有意な相関がみられたものの，比例誤差が生じており，両機種間で特定方向に生じる乖離がみられた．EndoKerのシステムでは従来のCDigitalCCameraCTD-10を用い，鏡面反射の原理を用いてスリット光で角膜内皮細胞を観察・撮影し，コンピュータを介してデジタル画像に変換，解析を行う新しい方式を導入している．イタリアにおける開発段階の正常人を対象とした報告では，EndoKerは良好な精度を得ている7）．30例を対象とした角膜内皮細胞密度の測定において，EndoKerにおける自動解析とアニュアルでの観測数では，0.2％の違いにとどまり，標準偏差はC4.3％であったと報告している．また，1例を除き，Bland-Alt.manplotにおいてC95％信頼区間内に含まれている．EndoK.erと非接触型スペキュラーマイクロスコープの比較でも同様の結果を得ており，両機種は臨床において類似した測定結果をもたらすと報告されている．既報と本研究との結果の違いの一つに，観測細胞数の差異が関与している可能性がある．既報では，230～500個の細胞数を対象としたのに対し，本研究ではC100個程度を対象とした．また，両機器間においてCCD測定値に比例誤差が生じていたことを踏まえて，全測定結果を確認すると，NSP9900IIはCEndoKerの測定結果と比較して測定幅が比較的大きいことがわかる．本研究においては，両機器の測定結果にNSP9900・とEndoKerの角膜内皮細胞密度の差（cells/mm2）4002000.200.4002,2002,6003,0003,400NSP9900・とEndoKerの角膜内皮細胞密度の平均（cells/mm2）図5Bland.Altmanplotによる細胞密度の測定値の差（NSP9900II.EndoKer）実線は平均値の差を示す（C－31.9Ccells/mm2）．破線はC95％信頼区間を示す（平均値＋1.96CSD＝70.6Ccells/mm2，平均値－1.96SD＝－134.4Ccells/mm2）．細胞密度の測定値の差は比例誤差を示した．対するマニュアルカウント（いわゆる真の測定値）を施行していないため，これ以上の精度比較は困難であるが，角膜内皮像を得た後の細胞境界の自動検出過程が関与している可能性がある．EndoKerではスリットランプのジョイスティックのわずかな操作で角膜内皮観察像の焦点が変化するため，自動解析結果の画面での角膜内皮像の細胞境界検出が甘くなる可能性が考えられた．EndoKerでは，比較的均一な大きさの細胞境界像を描出するのに対して，NSP9900CIIでは細胞の大小不同をより鋭敏に描出している可能性がある．この細胞境界の自動検出の程度の違いにより，両機器間でのCCV値に有意な差が生じ，CD測定幅の違いが生じた可能性を考えている．EndoKerは，臨床で幅広く活用できる可能性がある．医師が診察室内でスリットランプを観察時にそのまま測定することが可能であり，角膜瘢痕などをマーカーとすることで特定の部位の角膜内皮を評価できる可能性もある．また，従来型のスペキュラーマイクロスコープに比べて，安価である．しかしその一方で，撮影技術の習熟が必要であるのは事実であり，現時点ではいかに良好な角膜内皮像を得られるか観察技術が測定結果を左右している可能性がある．また，従来型のスペキュラーマイクロスコープでは主要なパラメータの一つである角膜厚の測定はできない．本研究では，スリット型スペキュラーマイクロスコープEndoKerは，従来型スペキュラーマイクロスコープとほぼ同等の角膜内皮解析結果が得られることが示された．手技に慣れる必要があるが，スリットランプでの観察中に定量的評価が可能であり，臨床的メリットがあると考えられた．文献1）BenetzCB,CYeeCR,CBidrosCMCetCal：SpecularCmicroscopy.In：KrachmerJ,MannisM,HollandE（eds）Cornea.Else.vierMosby,Philadelphia,p177-203,20112）澤充：【角膜内皮を見直す】スペキュラーマイクロスコープの意味するもの．あたらしい眼科C15：1395-1400,C19983）BourneCWM,CKaufmanCHE：SpecularCmicroscopyCofChumanCcornealCendotheliumCinCvivo.CAmCJCOphthalmolC81：319-323,C19764）BronCAJ,CBrownCNA：EndotheliumCofCtheCcornealCgraft.CTransOphthalmolSocUKC94：863-873,C19745）山田昌和：【前眼部疾患と病変の診かた】検査法スペキュラーマイクロスコープ．眼科C47：1405-1411,C20056）井上智之：【角膜内皮疾患を理解する】角膜内皮細胞の臨床的観察法．あたらしい眼科C26：141-146,C20097）FerraroCL,CCozzaCF,CScialdoneCACetCal：MorphometricCAnalysesCbyCaCnewCslit-lampCendothelialCbiomicroscope.CCorneaC35：1347-1354,C20168）TufoCS,CPrazzoliCE,CFerraroCLCetCal：Variable-sizeCbeadClayerCasCstandardCreferenceCforCendothelialCmicroscopes.CCorneaC36：236-240,C20179）LaingRA,SanstromMM,BerrospiARetal：Changesinthecornealendotheliumasafunctionofage.ExpEyeResC22：587-594,C1976＊＊＊