———————————————————————-Page1（97）3790910-1810/09/\100/頁/JCLS45回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科26（3）：379385，2009cはじめに1972年Kerrら1）が発表したアポトーシスは，生理的に生じる不要細胞や病理的に生成される傷害細胞を積極的に排除する機構で，細胞の形態変化を伴う現象である．しかしこの形態変化は数分間で終了するためヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）を施した組織切片にアポトーシスがみつかることはまれである．アポトーシスの検索には，その本質がDNAのヌクレオソーム単位での断片化であることを踏まえて，当初から組織切片に特殊な染色を施して検鏡するのが一般的である2,3）．今回角膜鉄粉異物のHE染色切片を検鏡していて，錆を貪食した上皮細胞にアポトーシスが多発する現象を発見する機会に恵まれたので報告する．I方法外傷後72時間以上を経過した角膜鉄粉異物症例（45歳，男性）から摘出した上皮層錆輪と，外傷後約30時間経過の角膜鉄粉異物症例（46歳，男性）で初回の角膜鉄粉異物摘出術で実質層錆輪を取り残し2週後に再摘出した残存錆輪を覆う増殖上皮を試料にした．2症例とも摘出した錆輪を研究材料とすることの了解を得た．切片作製の手順は既報で詳述した4）．切片はHE染色と錆を特異的に染色するPerls染色を施した．上皮層錆輪は連続切片のうち錆輪の中央部分の1枚を示した．〔別刷請求先〕松原稔：〒675-1332小野市中町275-1松原眼科医院Reprintrequests：MinoruMatsubara,M.D.,MatsubaraEyeClinic,275-1Naka-cho,Ono-shi,Hyogo-ken675-1332,JAPAN角膜錆輪を覆う上皮にみられる細胞死の組織学的研究松原稔松原眼科医院HistologicalStudyofEpitheliumCellDeathwithCornealRustRingMinoruMatsubaraMatsubaraEyeClinic角膜鉄粉異物が起こす細胞死を研究した．鉄粉異物周囲の上皮と取り残した錆輪を覆う増殖上皮から連続切片を作製，ヘマトキシリン・エオジン染色とPerls染色を施し，錆に接触した細胞に起こる変化を光学顕微鏡で調べた．錆輪を覆う増殖上皮では錆を貪食した細胞はネクローシスを起こさなかったが，核クロマチンの凝縮と断片化が起こり細胞質が縮小して隣接細胞との間に大きな間隙をつくった好酸性円形のアポトーシス細胞と，細胞質がくびれちぎれたアポトーシス小体が全細胞の4.1％にみられた．これらの細胞では核断片化数と細胞質細分化数が3以上の細胞が55％を占めた．アポトーシスを起こした細胞は細胞内にPerls染色に染まる顆粒を含み，細胞分裂の多い場所に一致して発生し，対をなすことから錆を貪食した細胞が分裂を始めるとアポトーシスを起こすと推測した．Weexaminedtheepitheliumsurroundingacornealironforeignbodyandtheepitheliumcoveringthecornealrustringremainingafterextraction.Specimenswereexaminedbylightmicroscopyafterstainingbyhematoxylin-eosinandPerlsstain.Intheepitheliumcoveringtherustring,cellssurroundthelamellawhichrustdeposited,anddidphagocytosis,butdidnotdevelopnecrosis.Nuclearchromatinandcytoplasmcondenseshowingtheacidophil,andcreatedalargegapbetweenthecells.Inthesecellsthenucleifragmented；membrane-boundcellsandapop-toticbodieswereobserved.Nuclearandcytoplasmiccondensationandapoptoticbodiesareobservedin4.1％ofcells；55％ofthesecellshad3ormoreofthenuclearorcytoplasmicfragmentation.Thecellwhichcausedapopto-sisincludedaparticledyedintracellularlywithPerls’stain,andweagreedinmanyplacesofmuchmitosis,andapairisbecome.Presumably,apoptosisresultedwhenthecellsthatphagocytizedrustbegantodivied.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）26（3）：379385,2009〕Keywords：細胞分裂，アポトーシス，ネクローシス，角膜鉄粉異物，角膜錆輪．celldivision,apoptosis,necrosis,cornealironforeignbody,cornealrustring.———————————————————————-Page2380あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009（98）残存錆輪を覆う増殖上皮は連続切片1020枚を載せたプレパラート15枚を作製し，各々から傷や皺のない切片を1枚選び，15枚の顕微鏡写真を印画紙に焼き付けた．写真からアポトーシスを起こした細胞（以下，アポトーシス細胞と略す）と上皮細胞を数え，切片の面積，切片の長さと厚さの最大値，実質層錆輪（錆の沈殿したラメラ）の面積と増殖上皮に接触する長さを計測し，Pearson積率相関係数を計算して表1に示した．アポトーシス細胞の定義は，核クロマチンが凝縮して核が小さくなること，核が3個以上になること，細胞質が縮小して丸くなり隣の細胞との間に間隙ができること，くびれて細分化した細胞数が3個以上になることのうち2つ以上の条件を満たす細胞とした（図1）．HE染色の光学表1錆輪を覆う増殖上皮の様相切片番号ア細胞数総細胞数切片面積切片の長さ切片の厚さ錆輪面積錆輪の長さ111291774047936368252703034721133034031137350063412412737141956185069418843281545767967771200734376307041,10083821344422735691929839226744068256749258552652751993365580071021644248102764683673622521197111954869769420041322121751860066717061227132546757561316112540614163714674611245428215622930040311116140平均2150766865317454331Pearson積率相関係数対ア細胞数0.930.880.810.800.190.34対総細胞数0.970.940.930.060.33ア細胞＝アポトーシス細胞．面積：100μm2．長さと厚さ：μm.図2アポトーシス細胞と隣接細胞との関係（HE染色，バー：10μm）a：a型．アポトーシス細胞が液胞の中央に配置．b：b型．液胞の壁の一部が隣接細胞と接触．c：c型．アポトーシス細胞が隣接する．abcab図1アポトーシスの条件（HE染色，バー：10μm）a：核クロマチン凝縮，偏在，断裂．b：細胞縮小で隣接細胞間に間隙発生，細胞質がくびれて細分化．———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009381（99）顕微鏡切片では細胞分裂像と鑑別がむずかしいため，核と細胞質の数を3個で区切った．総細胞数は核の数で代用した．15枚のプレパラートから傷や皺のない切片86枚を選び，その顕微鏡写真を印画紙に焼き付けてアポトーシス細胞の核の断片化数と細胞質の細分化数を数えた．さらにアポトーシス細胞と隣接細胞との関係を3つに分類して核数と細胞数との関連を調べた．縮小した細胞が単一液胞の中央にあるのをa型（図2a），形態的に異なる隣の細胞と壁の一部で密着しているのをb型（図2b），2個のアポトーシス細胞が密着しているのをc型（図2c）とした．アポトーシス細胞の核の数を縦に細胞質の数を横に取り表2に示し，さらにa型，b型，c型の数を示した．アポトーシス細胞の顕微鏡写真を同じ様式で示した．II結果1.角膜上皮層錆輪の上皮細胞にみられる細胞死（ネクローシス）（図3）長径120μmの大きな水疱を1020μm幅の錆が囲む．水疱内壁に腐蝕して直径が数μmの球になった鉄が虫食状に残り，水疱内部には周辺では密に中央では粗に錆が広がる．水疱内径は細隙灯および実体顕微鏡写真の鉄粉の大きさに一致するので，最初は水疱全体が鉄であったことが推測できる．水疱の下方には錆で縁取られた大小不同の水疱が並び，水疱には細胞の残滓と錆が含まれる．形の残っている細胞では細胞膜に錆が数珠状に並び，形の崩れた細胞は核が崩壊，表2錆輪を覆う増殖上皮にみられるアポトーシス細胞の核断片化数と細胞質のくびれ細分化数細胞質のくびれ細分化数123456以上計核断片化数0a10a6a7a3a3a6a3579b6199b89125b11474b6728b2323b14428b3686.4％c88.1％c410.2％c46.0％c42.3％c21.9％c334.9％c251a45a13a16a10a4a1a89207b15189b73149b13187b7433b298b7573b46516.9％c117.3％c312.2％c27.1％c32.7％c0.7％c46.7％c192a14a17a5a2a2aa4036b2146b2724b1714b128b57b5135b872.9％c13.8％c22.0％c21.1％c0.7％c10.6％c211.0％c83a3a4a1a2aaa109b614b109b87b51b11b141b310.7％c1.1％c0.7％c0.6％c0.1％c0.1％c3.3％c04a3a2a1a1a1aa813b93b14b32b11b2b225b161.1％c10.2％c0.3％c0.2％c0.1％c0.2％c2.0％c15以上a7a3aaaa5a1512b57b4bbb5b24b91.0％c0.5％cccc0.4％c2.0％c0計a82a45a30a18a10a12a197356b253258b204311b273184b15971b5846b291226b97629.0％c2121.0％c925.4％c815.0％c75.8％c33.8％c5100.0％c53枠内の数値とa，b，cの数値はアポトーシス細胞数．％はアポトーシス細胞総数に対する百分率．図3上皮層錆輪周囲の上皮細胞に起こるネクローシス（HE染色，バー：50μm）———————————————————————-Page4382あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009（100）細胞質は溶解して残滓を残し，細胞膜に沈殿した錆がわずかに残る．2.残存錆輪を覆う増殖上皮に起こる細胞死（アポトーシス）（図4）図4の写真は残存錆輪を覆う増殖上皮のほぼ中央の切片である．左に向かって上皮が伸び先端は折り返している．左半分には不規則に破断した実質層錆輪が残る．右半分では3重になった増殖上皮の間にわずかに錆輪が残る．錆輪に接した一部の細胞は核クロマチンが凝縮，細胞質が濃縮して好酸性を示す（f）．ほとんどの細胞は貪食した錆を細胞質内に含みながら形態的な変化を起こさない（g）．これらの細胞は増殖する細胞に押されて錆輪から離れ，78細胞列離れた位置で，核クロマチン凝縮と細胞質縮小で円形になり強い好酸性を示し，隣の細胞との間に間隙をつくる（a）．核の断片化と細胞質のくびれを起こし（b），アポトーシス小体に至る（c）．これらのアポトーシス細胞は増殖上皮表面から排出される（d）．アポトーシス細胞は錆を含むが，その隣で錆を含まない細胞の分裂像がみられる（h,i）．錆輪の貪食が終了したあとに進入した上皮細胞は活発に分裂するが，アポトーシスは起こさない（e,j）．3.残存錆輪を覆う増殖上皮の様相（表1）アポトーシス細胞数は全細胞数の4.1％を占める．アポトーシス細胞数は総細胞数に強い相関を示し，残存錆輪を覆う増殖上皮にみられるアポトーシスが細胞自体に起因する現象であることを示唆する．総細胞数は面積に強い相関を示す．図4錆輪を覆う上皮細胞に起こるアポトーシス染色法無記載はHE染色．バー：弱拡大（×40）100μm.強拡大（×100）10μm．強拡大写真aeの出所は□で示す．fjの出所は隣接切片のため該当部位を○で示す．a：核クロマチン凝縮・偏在．b：細胞質がくびれて細分化．c：アポトーシス小体．d：アポトーシス細胞の排出．e：錆を含まない細胞の分裂．f：錆輪に接触した細胞のアポトーシス．g：錆を貪食したした細胞．矢印は錆．Perls染色．hi：錆を含む細胞のアポトーシス，隣に錆を含まない細胞の分裂．矢印は錆．h：Perls染色．j：錆の貪食終了跡に進入した細胞の分裂．fgbahidejcafghijbcde———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009383（101）4.残存錆輪を覆う増殖上皮にみられるアポトーシスの形と数（表2，図5）核1個と細胞1個のアポトーシス細胞が最も多く全体の16.9％を占め，核1個と細胞3個が12.2％，核0個と細胞3個が10.2％で，残りは10％以下である．細胞分裂の可能性のある核が1個か2個，好酸性の細胞質が1個か2個の細胞は全アポトーシス細胞の45％で，核と細胞質が3個以上の細胞が全アポトーシス細胞の55％を占める．a型は核2個図5a核断片化数0，細胞質のくびれ細分化数：上段1～5，下段6以上（HE染色，バー：10μm）図5b核断片化数1，細胞質のくびれ細分化数：上段1～5，下段6以上（HE染色，バー：10μm）図5c核断片化数2，細胞質のくびれ細分化数：1～5（HE染色，バー：10μm）———————————————————————-Page6384あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009（102）と細胞1個のアポトーシス細胞では39％を占め，核2個と細胞2個のアポトーシス細胞では37％を占めた．全体でみるとa型は16％，b型は80％，c型は4％で，84％のアポトーシス細胞が隣の細胞と対をなしている．III考按錆に触れた細胞にみられる細胞死にはネクローシスとアポトーシスがある．ネクローシスは細胞膜の破壊から始まる細胞死で突然の事故死にたとえられる．ある範囲の細胞が集団で侵され，細胞膜の破綻が起こるため細胞内外の浸透圧の均衡が破れ細胞は膨化し，細胞内容物があふれ出し自己融解が起こり，炎症細胞が集まり周囲を傷害する．上皮層錆輪周囲にみられるネクローシスは，涙に包まれた鉄の表面に発生する通気差電池のカソードにNaOHが生成され，この水酸基が細胞膜の脂肪酸を鹸化して細胞膜を溶かすので，上皮層錆輪周囲の上皮細胞は融解してネクローシスが起こると考える．アポトーシスはプログラムされた細胞死で自殺にたとえられる．周囲から孤立して単独の細胞に起こる現象で，核クロマチンの凝縮，核内偏在，断片化が起こる．細胞質は縮小し強い好酸性を示し，周囲の細胞との間に間隙を作り，最後に核が断片化され細胞質が細分化されて小さな断片（アポトーシス小体）になる．このアポトーシス小体は実質組織では隣接する細胞に貪食されるが，上皮組織では表面から排出される．炎症細胞の出現はない．残存錆輪を覆う増殖上皮ではアポトーシスの全過程が存在する．生化学的検査は行っていないが，形態的特徴からアポトーシスと考える．残存錆輪を覆う増殖上皮細胞に起こるアポトーシスの発生機序を考察する．増殖上皮細胞は分裂をくり返して欠損部を充し，残存錆輪の錆を貪食する．錆を貪食した細胞は表面から排出され，同時に錆を含まない細胞も離脱落する．増殖細胞の4.1％がアポトーシスを起こすが，その細胞質内にはPerls染色に染まる顆粒や残滓がみられる．アポトーシス細胞に隣接して図5d核断片化数3，細胞質のくびれ細分化数：1～5（HE染色，バー：10μm）図5e核断片化数4，細胞質のくびれ細分化数：1～5（HE染色，バー：10μm）図5f核断片化数5以上，細胞質のくびれ細分化数：1～多数（HE染色，バー：10μm）———————————————————————-Page7あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009385（103）正常な細胞分裂像がみられるので，錆を貪食した細胞も細胞周期に従い同じ場所で分裂を始めたことが推測できる．アポトーシス細胞の84％は隣の細胞と対をなしており分裂の途中で変化をきたしたことを疑わせる．アポトーシス細胞は，細胞内に錆を含み，細胞分裂の多い場所に一致して発生し，細胞が対をなしていることから錆を貪食した細胞が分裂を始めるとアポトーシスを起こすと推測する．今研究ではTUNEL法によるアポトーシスの確定が将来の課題として残る．稿を終えるにあたり三重大学大学院医学系研究科ゲノム再生医学講座修復再生病理学吉田利通教授にご指導いただいたことに深く御礼申し上げます．文献1）KerrJFR,WyllieAH,CurrieAR：Apoptosis：Abasicbiologicalphenomenonwithwiderangingimplicationsintissuekinetics.BrJCancer26：239-257,19722）藤田和子：TUNEL法．アポトーシス実験プロトコール（田沼靖一監修），細胞工学別冊，p86-96，秀潤社，19983）恵口豊，辻本賀英：アポトーシス研究を支えた実験法．細胞死・アポトーシス（辻本賀英編），p28-37，羊土社，20064）松原稔，吉田宗儀，増子昇：角膜錆輪の組織学的研究．臨眼58：1957-1960,2004＊＊＊