《原著》あたらしい眼科30（10）：1467.1471，2013cレバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性に関する検討福田正道＊1中嶋英雄＊2春田淳平＊2柴田伸亮＊1柴田奈央子＊1長田ひろみ＊1関祐介＊1三田哲大＊1佐々木洋＊1＊1金沢医科大学眼科学講座＊2大塚製薬株式会社赤穂研究所SafetyofRebamipideOphthalmicSuspensionforCornealEpithelialCells：InVitroandInVivoStudyMasamichiFukuda1）,HideoNakashima2）,JunpeiHaruta2）,ShinsukeShibata1）,NaokoShibata1）,HiromiOsada1）,YusukeSeki1）,NorihiroMita1）andHiroshiSasaki1）1）DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,2）AkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.レバミピド点眼液（商品名：ムコスタR点眼液UD2％，防腐剤フリー）の角膜上皮に対する安全性について塩化ベンザルコニウム（benzalkoniumchloride：BAK）を対照に用いて評価した．①培養ヒト角膜上皮細胞（humancornealepithelialcellline：HCE-T）に0.001％，0.002％，0.005％，0.01％BAK溶液またはレバミピド点眼液を0，5，15，30，60分間接触させた後に細胞生存率を測定した．②家兎に0.002％，0.005％，0.01％BAK溶液またはレバミピド点眼液を単回点眼し1分後に涙液を回収してlactatedehydrogenase（LDH）活性を測定した．③また家兎に0.01％BAKまたはレバミピド点眼液を5分ごとに5回点眼し，最終点眼の2分後に角膜抵抗（cornealresistance：CR）を測定した．BAKは濃度および時間依存的に角膜上皮細胞の生存率を低下させたのに対し，レバミピド点眼液では細胞生存率の低下はみられなかった．BAKは濃度依存的に涙液LDH活性を増加させたのに対し，レバミピド点眼液群でのLDH活性は生理食塩液と同程度であった．また，BAK群ではレバミピド点眼液群と比較して有意にCR比が低値を示した．今回の結果からレバミピド点眼液は角膜上皮障害をひき起こすことはないと考えられ，安全面に優れたドライアイ治療薬である．Thisstudyevaluatedthesafetyofrebamipideophthalmicsuspension（MucostaRophthalmicsuspensionUD2％）,usingbenzalkoniumchloride（BAK）ascontrol.①Culturedhumancornealepithelial（HCE-T）cellswereincubatedwith0.001％,0.002％,0.005％or0.01％BAKsolution,orrebamipideophthalmicsuspensionfor0,5,15,30and60minutes；thecellswerecountedateachtimepointtocalculatethecellsurvivalrate（％）.②Rabbiteyeswereinstilledwith50μLof0.002％,0.005％or0.01％BAKsolution,orrebamipideophthalmicsuspension,andlactatedehydrogenase（LDH）inthetear.uidwasmeasuredat1minuteafterinstillation.③Rabbiteyesweretheninstilledwith50μLof0.01％BAKsolutionorrebamipideophthalmicsuspension5timesat5-minuteintervals；cornealresistance（CR）wasmeasuredat2minutesafterthelastinstillation.BAKsolutioncausedaconcentration-andtime-dependentdecreaseincellsurvivalrate,whereastherewasnocellsurvivalratedecreaseintherebamipideophthalmicsuspensiongroup.InstillationofBAKsolutionincreasedtearLDHactivityinacon-centration-dependentmanner；however,LDHactivityintherebamipideophthalmicsuspensiongroupwasatthesamelevelasthatinthesalinegroup.Also,BAKinstillationresultedinsigni.cantCRratiodecreasecomparedtorebamipideophthalmicsuspension.Theresultsoftheseinvitroandinvivostudiessuggestthatamongdryeyetherapeuticagents,rebamipideophthalmicsuspensionispotentiallysaferforpatients.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）30（10）：1467.1471,2013〕Keywords：レバミピド点眼液，塩化ベンザルコニウム（BAK），細胞生存率，涙液LDH活性，角膜抵抗．rebam-ipideophthalmicsuspension,benzalkoniumchloride（BAK）,cellviability,tearLDHactivity,cornealresistance.〔別刷請求先〕福田正道：〒920-0293石川県河北郡内灘町大学1-1金沢医科大学眼科学講座Reprintrequests：MasamichiFukuda,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,1-1Daigaku,Uchinada-machi,Kahoku-gun,Ishikawa920-0293,JAPAN0910-1810/13/\100/頁/JCOPY（123）1467はじめにドライアイの治療はこれまで人工涙液やヒアルロン酸ナトリウム点眼液による点眼治療が主流であり，一部重症例に対しては外科的治療が行われてきたが，最近，ジクアホソルナトリウム点眼液ならびにレバミピド点眼液が相ついで上市された．ジクアホソルナトリウム点眼液は結膜からの水分分泌促進作用1），角結膜からのムチン分泌促進作用2）を有することが報告されている．また，レバミピド点眼液については角結膜のムチン増加作用3,4）に加えて，結膜ゴブレット細胞の増加作用4）や角結膜上皮微細構造の修復作用5）などが報告されている．このように，さまざまな薬理作用を持ったドライアイ治療用点眼薬が複数開発されたことでドライアイの治療法は多様化し，その選択肢は広がっている．一般的に点眼薬には薬理作用に関与する主剤に加えて種々の添加物が含有されており，特に塩化ベンザルコニウム（benzalkoniumchlo-ride：BAK）に代表される防腐剤は優れた防腐効力を示す一方で，涙液が減少し角結膜に障害を有するドライアイ患者においてはその細胞障害性による悪影響が懸念される6.8）．このため薬理作用の違いだけでなく防腐剤の有無に関してもドライアイ治療用点眼薬の選択における重要な判断材料となる可能性がある．レバミピド点眼液は防腐剤フリーのユニットドーズ製剤であることから，防腐剤を含有する他のドライアイ治療用点眼薬に比べて細胞障害性に対する懸念は比較的少ないと推測される．本研究では培養ヒト角膜上皮細胞を用いた評価系（invitro試験）に加え，家兎での涙液中lactatedehydrogenase（LDH）量の測定ならびに角膜抵抗測定装置による評価法（invivo試験）によりBAKを対照としてレバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性を評価した．I実験材料1.使用薬剤2％レバミピド点眼液は，市販の商品名ムコスタR点眼液UD2％（大塚製薬）および塩化ベンザルコニウム（東京化成）を使用した．2.使用動物ニュージーランド成熟白色家兎（NZW；体重2.0.3.5kg）を本実験に使用した．動物の使用にあたり，金沢医科大学の動物使用倫理委員会の使用基準および「大塚製薬株式会社動物実験指針」を遵守して実施した．また，実験はARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmolo-gy）のガイドラインに従って動物に負担がかからないように配慮して行った．3.使用細胞株細胞株はSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，購入元：理化学研究所）を使用し，10％fetalbovineserum（FBS）添加Dulbecco’sModi.edEagleMedium：Nutrient1468あたらしい眼科Vol.30，No.10，2013MixtureF-12（DME/F-12）培地で37℃，5％CO2下で培養した．4.角膜抵抗測定装置角膜抵抗（cornealresistance：CR）値の測定には，角膜抵抗測定装置（cornealresistancedevice，CRDFukudamodel2007）を用いた9,10）．本装置は角膜コンタクトレンズ（CL）電極（メイヨー製）とファンクション・ジェネレータ（Dagatron,Seoul，Korea），アイソレーター（BSI-2；BAKElectronicsInc.,USA）およびPowerLabシステム（ADInstruments，Australia）から構成されている．角膜CL電極はアクリル樹脂製で家兎角膜形状に対応する直径とベースカーブとを有している．弯曲凹面に設けられた関電極および不関電極の材質はいずれも金で，その外径（直径）はそれぞれ12mm，4.8mm，および幅が0.8mm，0.6mmである．測定条件は交流，周波数：1,000Hz，波形：duration，矩形波：5ms，電流：±50μAで設定した．II実験方法1.培養ヒト角膜上皮細胞によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）HCE-Tを96wellプレートに播種し，10％FBS含有DME/F-12培地で37℃，5％CO2下で一昼夜培養した．FBS非含有培地で洗浄した後，培地（コントロール）またはBAK溶液（0.001％，0.002％，0.005％，0.01％；培地で希釈），レバミピド点眼液を0，5，15，30，60分間接触させた．培地で洗浄後，CellCountingKit-8（同仁化学）を添加し，37℃で3時間インキュベートした後，マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス）で450nmにおける吸光度を測定した．培地接触0分における細胞数を100％として各被験液接触後の細胞生存率を求めた．また，各時間の細胞生存率を用いて回帰分析により50％細胞障害時間（50％celldamagetime：CDT50）値を算出した．各値は4例の平均値±標準誤差を示す．2.涙液LDHassayによるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）成熟白色家兎にBAK溶液（0.002％，0.005％，0.01％）またはレバミピド点眼液50μLを両眼に単回点眼し，1分後にマイクロキャピラリー（Drummond）で涙液を1μL回収した．生理食塩液で60μLにボリュームアップした後，LDH-細胞毒性テストワコー（和光純薬）を使用してLDH活性を測定した．なお，標準曲線の作成には精製LDH（オリエンタル酵母）を用いた．各値は8例の平均値±標準誤差を示す．3.角膜抵抗測定法によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invivo）成熟白色家兎に生理食塩液または0.01％BAK溶液，レバミピド点眼液50μLを5分ごとに両眼に5回点眼し，5回目（124）点眼終了の2分後にCRを測定した．CRの測定には角膜抵抗測定装置を用い，CR値（Ω）とCR比（％）の算出はつぎのように行った6,7）．CR値（Ω）＝電圧（V）/電極（A）CR比（％）＝点眼後のCR値/点眼前のCR値×100各値は4.6例の平均値±標準誤差を示す．4.統計解析コントロール群に対する各群の細胞生存率をTwo-wayrepeatedmeasuresANOVA（analysisofvariance）により検定するとともに，各測定時間でコントロール群に対するDunnett’stest（Two-tail）を実施した．LDH活性値は対数変換により正規化した後でBAK溶液については生理食塩液を含めてWilliams’test（Upper-tail）を行い，レバミピド点眼液については生理食塩液に対するStudent’st-testを行った．各群のCR比はStudent’st-testで解析した．いずれの検定も5％を有意水準とした．III結果1.培養ヒト角膜上皮細胞によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）培地接触0分における細胞生存率（100％）に対する各被験液接触後の細胞生存率（平均値±標準誤差）を図1に示す．BAK溶液群の細胞生存率は濃度および時間依存的に低下し，Two-wayrepeatedmeasuresANOVAによる解析ではいずれの濃度のBAK溶液群においても細胞生存率は有意に低値を示した．0.001％BAK溶液群では30分後以降で有意に低値を示し，細胞生存率は30分で72.0±6.3％，60分で38.6140：Control（培地）：0.001％BAK溶液：0.005％BAK溶液：レバミピド点眼液：0.002％BAK溶液：0.01％BAK溶液120±6.9％であった．0.002％BAK溶液群の細胞生存率は15分後以降で有意に低値を示し，その値は15分後に28.7±6.0％，30分後に3.7±3.0％であった．0.005％および0.01％BAK溶液群の細胞生存率は接触5分後でそれぞれ4.9±1.6％および3.9±0.2％であった．一方，レバミピド点眼液群では60分後まで細胞生存率が低下することはなく，統計学的にもコントロール群に対して差は認められなかった（Two-wayrepeatedmeasuresANOVA）．細胞生存率から算出したCDT50値を表1に示す．BAK溶液群のCDT50（分）はBAK濃度に依存して短縮した（0.001％BAK溶液：49.88分，0.002％BAK溶液：13.91分，0.005％BAK溶液：2.63分，0.01％BAK溶液：2.60分）のに対して，レバミピド点眼液群ではコントロールと同様に60分以上であった．2.涙液LDHassayによるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）各被験液点眼後の涙液LDH活性値（平均値±標準誤差）を図2に示す．BAK溶液は濃度依存的にLDH活性を増加させ，生理食塩液群が474.0±62.0Unit/Lであったのに対し，0.002％BAK溶液群が1220.1±322.9Unit/L，0.005％BAK溶液群が4371.8±1502.2Unit/L，0.01％BAK溶液群表1培養ヒト角膜上皮細胞におけるレバミピド点眼液およびBAK溶液のCDT50（分）点眼液CDT50（分）Control（培地）＞60レバミピド点眼液＞600.001％BAK溶液0.002％BAK溶液0.005％BAK溶液0.01％BAK溶液49.8813.912.632.606040＊＊＃＃100,000＊＊＊＊細胞生存率（％）100涙液LDH活性（Unit/L）＊10,000NS1,000100＊＊＃＃10＊＊＃＃＊＊＃＃1時間（分）生理食塩液レバミピド0.002％0.005％0.01％点眼液BAK溶液BAK溶液BAK溶液図1培養ヒト角膜上皮細胞によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）図2涙液LDHassayによるレバミピド点眼液およびBAK##p＜0.01vs.Control（培地）；Two-wayrepeatedmeasures溶液の安全性評価（invitro）ANOVA.＊p＜0.05，＊＊p＜0.01；Williams’test（Upper-tail）.＊＊p＜0.01vs.Control（培地）；Dunnett’stest（Two-tail）.NS：Notsigni.cant；Unpairedt-test.（125）あたらしい眼科Vol.30，No.10，20131469CR比（％）NSNS＊1201101009080生理食塩液レバミピド0.01％点眼液BAK溶液図3角膜抵抗測定法によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invivo）＊p＜0.05,NS：Notsigni.cant；Unpairedt-test.が21562.2±4801.4Unit/Lを示し，生理食塩液に対し0.002％BAK溶液で2.6倍，0.005％BAK溶液で9.22倍，0.01％BAK溶液で45.5倍に増加した．一方，レバミピド点眼液群のLDH活性は327.8±74.0Unit/Lを示し，生理食塩液群と同程度であった．3.角膜抵抗測定法によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invivo）角膜抵抗測定法におけるCR比（平均値±標準誤差）を図3に示す．0.01％BAK溶液群のCR比（91.7±2.9％）は生理食塩液群（101.1±3.3％）およびレバミピド点眼液群（111.1±5.8％）のいずれに対しても低値を示し，レバミピド群に対しては有意に低値であった．IV考按わが国ではドライアイ治療用点眼薬としてヒアルロン酸ナトリウム点眼液およびジクアホソルナトリウム点眼液に加えてレバミピド点眼液が上市され，近年点眼治療の選択肢が広がっており，これに伴い涙液の層別治療（tear.lmorientedtherapy：TFOT）の概念11）が提唱され，それぞれの点眼薬の薬理作用に基づいた治療が行われている．一般的に点眼薬には有効成分以外にもさまざまな添加物が含有されており，特にBAKおよび塩化ベンゼトニウム，グルコン酸クロルヘキシジンなどの防腐剤が角膜上皮に与える影響は無視できない6.8）．そこで今回レバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性についてBAKを対照にinvitroおよびinvivo試験系で評価した．まずinvitro試験として培養ヒト角膜上皮細胞を用いて細胞生存率を指標に検討した．BAK溶液は濃度および接触時間依存的に細胞生存率を低下させ細胞障害作用を示したのに対して，レバミピド点眼液ではコントロールと同様に1470あたらしい眼科Vol.30，No.10，2013CDT50は60分以上を示し，BAK溶液で検出されたような細胞障害性は認められなかった．この試験系は被験液の細胞障害作用を検出する方法としては非常に感度の高い評価系ではあるが，涙液による希釈が考慮されていない点，また重層化された角膜上皮とは異なり単層細胞である点において生体とは大きく異なる．そこで，生体での影響を推察するためにLDHassayおよび角膜抵抗測定法を用いたinvivo試験系にてさらなる検討を実施した．涙液中のLDH量はCLの装用12）やBAKの点眼11）により上昇することが報告されており，オキュラーサーフェスの障害を定量的に評価することのできる指標であることから本研究でもLDHassayにより細胞障害性を評価した．その結果，BAK溶液単回点眼後の涙液LDH活性は生理食塩液に対して0.002％BAK溶液で2.6倍，0.005％BAK溶液で9.22倍，0.01％BAK溶液で45.5倍を示し，BAKの濃度依存的に涙液中のLDH量が増加した．これは細胞膜が傷害されてLDHが涙液中に放出されたことを意味し，BAKは単回点眼でも細胞に障害を与えることが示唆された．これに対してレバミピド点眼液群のLDH活性は生理食塩液と同程度を示したことから，レバミピド点眼液の単回点眼によるオキュラーサーフェスへの影響はほとんどないと推測された．また，筆者らはこれまでに角膜抵抗測定法を用いて種々の点眼液の細胞障害性について検討してきた6,9,13,14）．そこで，本研究でもこの角膜抵抗測定法を用いて評価したところ，BAKが角膜抵抗を低下させる傾向を示したのに対して，レバミピド点眼液では角膜抵抗の低下を認めなかった．以上のことから，BAKが角膜上皮を含むオキュラーサーフェスに対して細胞障害性を示す可能性があること，ならびに防腐剤フリーのレバミピド点眼液は潜在的に安全面に優れたドライアイ治療薬であることが示唆された．今回明らかとなったBAKの細胞障害作用が臨床においてどの程度問題となるのかについては不明であるものの，ドライアイ患者では涙液が減少していることに加え，角結膜上皮に障害を有していることから正常眼と比較してBAKの影響を受けやすいと考えられ，BAKを含有するドライアイ治療薬を点眼することによって角結膜上皮障害が発症/増悪する可能性は否定できない．ドライアイ治療用点眼薬を選択する際には，個々の点眼薬の持つ薬理作用だけでなく，防腐剤の有無やその種類による角膜上皮障害の発症/増悪のリスクについても十分に考慮することが重要であると考える．文献1）FujiharaT,MurakamiT,FujitaHetal：ImprovementofcornealbarrierfunctionbytheP2Y2agonistINS365inaratdryeyemodel.InvestOphthalmolVisSci42：96-100,2001（126）2）FujiharaT,MurakamiT,NaganoTetal：INS365sup-presseslossofcornealepithelialintegritybysecretionofmucin-likeglycoproteininarabbitshort-termdryeyemodel.JOculPharmacolTher18：363-370,20023）UrashimaH,OkamotoT,TakejiYetal：Rebamipideincreasestheamountofmucin-likesubstancesontheconjunctivaandcorneaintheN-acetylcysteine-treatedinvivomodel.Cornea23：613-619,20044）UrashimaH,TakejiY,OkamotoTetal：Rebamipideincreasesmucin-likesubstancecontentsandperiodicacidSchi.reagent-positivecellsdensityinnormalrabbits.JOculPharmacolTher28：264-270,20125）中嶋英雄，浦島博樹，竹治康広ほか：ウサギ眼表面ムチン被覆障害モデルにおける角結膜障害に対するレバミピド点眼液の効果．あたらしい眼科29：1147-1151,20126）福田正道，矢口祐基，藤田信之ほか：ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の角膜細胞に対する影響の検討．あたらしい眼科28：549-552,20117）UematsuM,KumagamiT,ShimodaKetal：In.uenceofalkylchainlengthofbenzalkoniumchlorideonacutecor-nealepithelialtoxicity.Cornea29：1296-1301,20108）ImayasuM,MoriyamaT,OhashiJetal：QuantitativemethodforLDH,MDHandalbuminlevelsintearswithocularsurfacetoxicityscoredbydraizecriteriainrabbiteyes.CLAOJ18：260-266,19929）FukudaM,SasakiH：Quantitativeevaluationofcornealepithelialinjurycausedbyn-heptanolusingacornealresistancemeasuringdeviceinvivo.ClinOphthalmol6：585-593,201210）福田正道，矢口裕基，萩原健太ほか：ラタノプロスト後発品点眼薬の角膜上皮障害と点眼薬の家兎眼内移行動態．医学と薬学68：283-290,201211）横井則彦，坪田一男：ドライアイのコアメカニズム─涙液安定性仮説の考え方─．あたらしい眼科28：291-297,201212）IchijimaH,ImayasuM,OhashiJetal：Tearlactatedehy-drogenaselevels.Anewmethodtoassesse.ectsofcon-tactlenswearinman.Cornea11：114-120,199213）福田正道，稲垣伸亮，萩原健太ほか：ラタノプロスト後発品点眼薬の角膜上皮細胞に対する安全性の検討．あたらしい眼科28：849-854,201114）福田正道，佐々木洋，高橋信夫ほか：角膜抵抗測定装置によるプロスタグランジン関連点眼薬の角膜障害の評価．あたらしい眼科27：1581-1585,2010＊＊＊（127）あたらしい眼科Vol.30，No.10，20131471