あたらしい眼科

《原著》あたらしい眼科35（5）：693.697，2018c慢性移植片対宿主病モデルマウスの結膜.におけるドナー由来線維芽細胞の集積五十嵐秀人小川葉子山根みお清水映輔福井正樹榛村重人坪田一男慶應義塾大学医学部眼科学教室CAccumulationofDonor-derivedFibroblastsinChronicGVHDConjunctivalFornixinaMouseModelHidetoIkarashi,YokoOgawa,MioYamane,EisukeShimizu,MasakiFukui,ShigetoShimmuraandKazuoTsubotaCDepartmentofOphthalmology,KeioUniversitySchoolofMedicine慢性移植片対宿主病（cGVHD）によるドライアイは移植後の主要な合併症であり，眼表面に難治性線維化をきたす．筆者らは，cGVHDモデルマウスを用いて，結膜.に集積するドナー由来線維芽細胞の集積を検出したので報告する．ドナーにC8週齢雄CB10.D2マウス，レシピエントに週齢をあわせた雌CBALB/cマウスを用いて，線維化を高度にきたすCcGVHDモデルマウスを作製した．BALB/cマウスによる同種同系移植を対照とした．移植後C3週時のレシピエント結膜の解析では，線維芽細胞のマーカーCHSP47陽性の小型線維芽細胞の集積部位を認めた．同一切片によるCY染色体CFISHを施行し，同一部位の細胞群に多数のCY染色体陽性像を見いだした．結膜.と涙腺排出導管付近に多数のドナー由来線維芽細胞が集積していた．ドナー由来線維芽細胞は結膜.の線維化の細胞源として排出導管を閉塞し，難治性線維化による重症ドライアイに関与することが示唆された．ChronicCgraft-versus-hostCdisease（cGVHD）isCaCmajorCcomplicationCafterCallogeneicChematopoieticCstemCcelltransplantation（HSCT）C,CwhichCcanCleadCtoCsevereC.brosisCofCtheCocularCsurface.CHere,CweCreportCaccumulationCofCdonor-derived.broblastsaroundthefornixoftheconjunctivainananimalmodelofcGVHD.Eight-week-oldmaleB10.D2mouseandage-matchedfemaleBALB/cmicewereusedasdonorsandrecipients,respectively,tocreatesclerodermatouscGVHD.BALB/cintoBALB/ctransplantrecipientswereusedascontrols.Usingconjunctivaltis-suesectionsat3weeksafterHSCT,wefoundaccumulationofsmall.broblasts,markedbytheirmarkerHSP47,withintheconjunctivalfornixandsurroundingtheori.ce’soflacrimalglandmainducts.AfterHSP47staining,weperformedCY-chromosomeC.uoresceinCin-situChybridization（Y-FISH）onCaCsingleCsection.CWeCfoundCHSP47＋CY-FISH＋C.broblastsConCtheCidenticalCsectionCofCtheCsameCarea.CTheseCresultsCsuggestedCthatCactivatedCdonor-derivedC.broblastsCsurroundingCconjunctivalCfornixCandClacrimalCglandCexocrineCmainCductsCareCrelatedCtoCrapidlyCprogressivedryeyerelatedtocGVHD.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）C35（5）：693.697,C2018〕Keywords：慢性移植片対宿主病，モデルマウス，線維化，ドナー由来線維芽細胞，Y-染色体CFISH，結膜．chron-icgraft-versus-hostdisease,mousemodel,.brosis,donor-derived.broblast,Y-chromosomeFISH,conjunctiva.Cはじめに造血幹細胞移植は年々増加傾向にあり，眼科領域の合併症対策も重要性が増している1）．造血幹細胞移植の晩期合併症の一つである慢性移植片対宿主病（chronicCgraft-versus-hostdisease：cGVHD）によるドライアイは，移植後眼科領域の合併症のなかでもっとも多く，移植例の約C50.60％に生じるとされている2）．cGVHDによるドライアイは難治例に進行する場合も多く，治療に苦慮するのが現状であり，病態の発症と進展に至る進行過程の解明と，よりよい治療法の確立が課題である3）．筆者らはこれまでにCcGVHDにより障害を受けた症例の涙腺に過剰な細胞外器質の蓄積による病的線維化と活性化ドナ〔別刷請求先〕小川葉子：〒160-8582東京都新宿区信濃町C35慶應義塾大学医学部眼科学教室Reprintrequests：YokoOgawa,M.D.,DepartmentofOphthalmology,KeioUniversitySchoolofMedicine,35Shinanomachi,Shinjuku-ku,Tokyo160-8582,JAPANー由来線維芽細胞の集積を認め，これらが涙腺の機能不全の原因となり，cGVHDによるドライアイの病態形成にかかわることを報告した4）．さらにモデルマウスを用いた病態の検討で，涙腺，皮膚，消化管にドナー由来間葉系幹細胞が生着し集積していることを報告した5）．臨床ではCcGVHDによる結膜病変の特徴として瞼球癒着，結膜.短縮，眼瞼線維性血管膜形成などとともに，ドライアイの発症後急速に眼表面の線維化が進行する6,7）．今回筆者らは，確立されたモデルマウスを用いて，cGVHDモデルマウスの結膜.に集積するドナー由来線維芽細胞を見いだしたので報告する．CI方法8週齢のCB10.D2雄（H-2d）マウスの骨髄細胞（1C×106）と脾臓細胞（2C×106）を，放射線照射後（7.0Cgray）の週齢が一致した雌CBALB/c（H-2d）レシピエントマウスに移植し，cGVHDモデルマウスを作製した8）．cGVHDが発症することが確認されている骨髄移植後C3週時に，レシピエントの標的組織である結膜粘膜の組織所見を解析した．病理切片にて結膜.の線維芽細胞の局在を確かめるために，ホルマリン固定パラフィン切片を用いて，線維芽細胞のマーカーとしてコラーゲン特異的分子シャペロンでありコラーゲン産生細胞の指標であるCheatCshockCproteinC47（HSP47）（CatalogCnum-ber；ADI-SPA-470-F,CClone名；M16.10A1，アイソタイプCIgG2b,ENZO,NewYork,USA）の発現を検討した．パラフィン切片を用いオートクレーブを用いた抗原賦活化法によりCHSP47の発現が良好に認められることを確認した．本抗体はマウスに交叉性がありマウス切片で紡錘形線維芽細胞を検出できることを確認した．Y染色体の検出にはCstarCFISHCkit（1200-YMCY3-02,Cambio,CCambridge,CU.K.）を用いてこれまでに報告されている方法に従って行った9）．活性化線維芽細胞がドナー由来かを検討するために，雄ドナーマウスから雌レシピエントマウスに移植したマウス結膜切片で蛍光免疫染色によりHSP47の発現の検討し，HSP47陽性線維芽細胞像を蛍光画像を共焦点顕微鏡（ZEN900LSMconfocalmicroscope,Zeiss,Germany）で取得したのち，カバーグラスをはずして同一切片で雌レシピエント切片でのCY-染色体の検出を試みた．HSP47蛍光染色を施行した組織切片と同一切片でCY-染色体.uoresceinCin-situChybridization（Y-FISH）施行後，共焦点顕微鏡下でCHSP47を発現する細胞と同一部位を探しCY-染色体陽性シグナルを探し検討した．HSP47蛍光染色とCY-FISH方法を以下にまとめて記載する．ホルマリン固定パラフィン切片を用いてキシレンにて脱パラフィン後，エタノール系列C95％，80％，60％，30％の順に各C5分間ずつ浸漬し親水化を行った．抗原賦活化液に切片を浸漬し，オートクレーブを用いてC120℃C20分の抗原賦活化を行ったのち，正常ヤギ血清をC30分反応，抗ヒトHSP47抗体（マウスに交叉性有り）をオーバーナイトC4℃で反応後，リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄，AlexaC488標識ヤギ抗マウス二次抗体を核染色物質CTO-PRO-3（T3605；サーモフィッシャー）と混合してC45分反応させた．PBSで洗浄後，退色防止剤入りマウント剤で封入した．共焦点顕微鏡で画像を取得後，カバーグラスをはずし，Y-FISHの行程に移行した．Y-FISHはC0.2N塩酸でC20分間反応させ，次にC80℃に予備加熱したチオシアン酸ナトリウム溶液（32002-32，ナカライテスク）にC10分間浸漬し，PBS洗浄を行った．37℃に予備加熱したペプシン溶液に切片をC10分間浸漬した後，グリシン溶液（161-18713，和光）にC1分間位浸漬した．PBSで洗浄後，4％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液を添加，2分間で組織を固定した．PBSで洗浄後，エタノール系列（30％，60％，80％，95％，100％）の順に各C1分間浸漬し脱水を行い風乾したのち，組織上にCY-染色体CFISHプローブ溶液を添加した．カバーガラスを用いて空気が入らないように被覆し，四隅をシールで封入した．75℃C10分間ディネイチャー後，プローブを載せた組織片スライドガラスを湿潤箱に入れアルミ遮光し，37℃でオーバーナイトでハイブリダイゼーションを行った．16時間後，カバーガラスのシールを取り除きC37℃に予備加熱した脱イオン化溶液で洗浄後，2C×塩化ナトリウム，クエン酸ナトリウム溶液（standardCsalineCcitrate：SSC）溶液で洗浄，37℃に予備加温したC10％CTween20＋4×SSC溶液でC10分間洗浄，PBS洗浄，TOPRO-3を用いて核染色を行った．洗浄後，同様に退色防止剤入り蛍光用マウント剤で封入しコンフォーカル共焦点顕微鏡で再度同一部位を探し撮影した．CII結果雄マウスパラフィン切片を用いた陽性コントロール切片ではCY染色体CFISHのみの検討では，結膜（図1a），網膜（図1b），脾臓細胞（図1c）ともにC95％以上の細胞にCY染色体の陽性像が観察され，Y-FISH単独での手技でCY-染色体を検出できることを確認した（図1）．同種同系骨髄移植後のコントロールマウス結膜.においては結膜上皮，間質ともに炎症および線維化所見に乏しく正常結膜に類似していた（図2a）．次に，同種異系骨髄移植後のCcGVHDモデルマウス結膜.を観察すると，コントロールに比して結膜上皮，間質に炎症細胞浸潤と（図2b）と線維化（図2c）を認めた．次に雄の野生型CBALB/cマウス涙腺のフォルマリン固定パラフィン組織切片を用いて，同一切片上でCHSP47の発現（図2d,上）とCY染色体CFISH（図2d,下）を検討し，蛍光結膜Y-FISH陽性コントロール網膜Y-FISH陽性コントロール脾臓細胞Y-FISH陽性コントロールabc図1雄BALB/cマウス結膜，網膜，脾臓細胞における陽性コントロールとしてのY.FISHシグナル像a：組織切片結膜．b：組織切片網膜．c：サイトスピンによる脾臓細胞．スケールバーa,c＝25μm,b＝50Cμm.染色とCY-FISHを同一切片で行う陽性コントロールとした．その結果，Y-FISHシグナルの検出率は単独でCY-FISHを行う場合より低下したが，約C80％以上の細胞にCY-FISHシグナルを検出した（図2d,下）．野生型マウス陽性コントロール切片においては正常組織であるため，HSP47陽性細胞はわずかであった．次に雌野生型マウス陰性コントロール組織切片を検討すると，野生型の正常組織であるためCHSP47陽性細胞はわずかで，活性化に乏しかった（図2e,上）．同一切片の陰性コントロール組織切片では，雌マウス由来の組織のため偽陽性と思われるC1個のシグナルを除いて，Y-FISHシグナルは認められなかった（図2e,下）．これらの結果より，同一切片上での免疫染色との複合方法によるCY-FISHを行ってもY-FISHシグナルは検出できることを確認した（図2d,下）．次にCcGVHDモデルマウス結膜.の同一切片では，HSP47染色所見では（図2f,上）結膜.周囲に集積する多数の小型のCHSP7陽性活性化線維芽細胞を認めた．同一切片上のCY染色体CFISHシグナルを線維芽細胞とほぼ同一部位に認め，多数のCHSP47＋線維芽細胞が集積する部位に一致して，Y-FISH＋細胞を検出した（図2f,下）．これらの結果はCcGVHDモデルマウスにおいて結膜線維化が高度で，結膜.および涙腺排出導管付近に多数のドナー由来の活性化線維芽細胞が集積していることを示唆していた．CIII考按慢性移植片対宿主病によるドライアイは瞼球癒着，結膜.短縮などの結膜線維化により重症化する例が多く認められる．骨髄移植では，移植前に大量化学療法，放射線療法などで炎症の前段階が生じている．骨髄移植後早期に生じる急性GVHDや感染などにより骨髄移植の標的臓器には骨髄細胞を動員するホーミングシグナルが存在すると考えられる10）．これまでの筆者らの研究で，ヒト涙腺に集積するドナー由来線維芽細胞の存在を見いだし報告した4）．病変部に集積する線維芽細胞の約半数がドナー由来であり，その割合はCcGVHDモデルマウスにおいても一致していた5）．今回の検討では，cGVHDモデルマウスを用いて，マウス結膜.の線維化部位に多数の小型のドナー由来線維芽細胞を見いだした．これらの活性化線維芽細胞の集積は結膜.の瞼球癒着や，結膜.短縮が生じる過程の主要な役割を果たすと考えられた．実験過程の改善点としては，活性化線維芽細胞のマーカーとして使用しているCHSP47の発現をパラフィン切片上で調べるために，抗原賦活化としてオートクレーブを用いてC120℃20Cminという強い熱処理が必要である．HSP47の蛍光染色の過程と同一切片でCYFISHを行う過程で，カバーグラスをはずすときに組織が若干移動する可能性があり，完全に一致した部位での細胞の検出がむずかしかった．その他，実験過程での温度の設定の変化，組織切片ではCY染色体の検出部位が組織の薄切により短縮されている染色体もある可能性があるため，検出率がC100％に至らない原因の一つと考えられた．免疫染色とCFISHの複合手技はC3.4日を要し，熱処理などの工夫に苦慮するためドナーにCGFPマウスを使用してホルマリンで短時間弱く固定後の凍結切片を用いてドナー細胞を検出するアプローチが現実的である．しかし，免疫染色でパラフィン切片にのみ染色される分子と複合法で検出する必要がある場合は本方法によるアプローチが必要である．GFPマウスを入手できない場合などにおいては，ドナーが雄，レシピエントが雌の切片を用いてCY-FISH法によるドナー細胞の多角的なアプローチによる検出方法も有用であると考えられた．臨床的に，結膜.には多数の涙腺の排出導管が開口する部位であり，この部位の過剰な線維化は排出導管の閉塞の原因の一つとなりうる．そのため，結膜.への活性化線維芽細胞の集積は，造血幹細胞移植後のドライアイの発症や進展過程に関与する可能性があると考えられた．また，これらのドナControlcGVHDcGVHD陽性control陰性controlcGVHDY.FISH/TOPRO.3HSP47/TOPRO.3図2cGVHDモデルマウス結膜.におけるドナー由来線維芽細胞の検出a：同種同系骨髄移植後のコントロールマウス結膜.．ヘマトキシリン・エオジン染色．結膜上皮，間質ともに炎症および線維化所見は乏しい．結膜.（＊）．b,c：同種異系骨髄移植後のCcGVHDモデルマウス結膜.．b：ヘマトキシリン・エオジン染色．c：マロリー染色．コントロールCaに比して結膜上皮，間質に炎症細胞と線維化を認める．結膜.（＊）．スケールバーCa,Cb,Cc＝50Cμm．Cd：雌マウス涙腺同一切片のCHSP47（緑）の発現（d,上）とCY染色体FISH（赤）（d,下）陰性コントロール．核（青）．e：雄マウス涙腺同一切片のCHSP47（緑）の発現（e,上）とCY染色体CFISH（赤）（e,下）陽性コントロール．核（青）．f：cGVHDモデルマウス結膜.の同一切片のCHSP47（緑）の発現（f,上）とCY染色体CFISH（赤）（f,下）．核（青）．結膜.周囲に集積する多数の小型のCHSP7陽性活性化線維芽細胞とY-染色体陽性シグナル．結膜.（＊）．スケールバーCd,e,f＝50Cμm.Cー由来線維芽細胞を制御することにより，難治性の眼表面線文献維化を抑制することが可能になるのではないかと考えられ1）JagasiaCMH,CGreinixCHT,CAroraCMCetCal；NationalCInsti-た．今後，ドナー由来線維芽細胞がCcGVHDによる難治性眼tutesCofCHealthCConsensusCDevelopmentCProjectConCCrite-表面線維化の発症と進展の過程に時間的，空間的にどのようriaCforCClinicalCTrialsCinCChronicCGraft-versus-HostCDis-ease：I.CTheC2014CDiagnosisCandCStagingCWorkingCGroupCに関与するか，さらに多様な薬剤投与によりその動態がどのreport.BiolBloodMarrowTransplantC21：389-401Ce381,Cように変化するかを詳細に調べることが必要と考えられた．20152）ShikariCH,CAntinCJH,CDanaCR：OcularCgraft-versus-hostdisease：areview.SurvOphthalmolC58：233-251,C2013利益相反：利益相反公表基準に該当なし3）TungCI：Currentapproachestotreatmentofoculargraft-versus-hostdisease.IntOphthalmolClinC57：65-88,C20174）OgawaCY,CKodamaCH,CKameyamaCKCetCal：DonorC.bro-blastchimerisminthepathogenic.broticlesionofhumanchronicCgraft-versus-hostCdisease.CInvestCOphthalmolCVisCSciC46：4519-4527,C20055）OgawaCY,CMorikawaCS,COkanoCHCetCal：MHC-compatibleCboneCmarrowCstromal/stemCcellsCtriggerC.brosisCbyCacti-vatingChostCTCcellsCinCaCsclerodermaCmouseCmodel.CElifeC5：e09394,C20166）RobinsonMR,LeeSS,RubinBIetal：Topicalcorticoste-roidCtherapyCforCcicatricialCconjunctivitisCassociatedCwithCchronicCgraft-versus-hostCdisease.CBoneCMarrowCTrans-plantC33：1031-1035,C20047）JabsCDA,CWingardCJ,CGreenCWRCetCal：TheCeyeCinCboneCmarrowCtransplantation.CIII.CConjunctivalCgraft-vs-hostCdisease.ArchOphthalmolC107：1343-1348,C19898）ZhangCY,CMcCormickCLL,CDesaiCSRCetCal：MurineCsclero-dermatousCgraft-versus-hostCdisease,CaCmodelCforChumanscleroderma：cutaneousCcytokines,Cchemokines,CandCimmunecellactivation.JImmunolC168：3088-3098,C20029）SugimotoCH,CMundelCTM,CSundCMCetCal：Bone-marrow-derivedCstemCcellsCrepairCbasementCmembraneCcollagenCdefectsCandCreverseCgeneticCkidneyCdisease.CProcCNatlCAcadSciUSAC103：7321-7326,C200610）SharmaCM,CAfrinCF,CSatijaCNCetCal：Stromal-derivedCfac-tor-1/CXCR4signaling：indispensableroleinhomingandengraftmentCofChematopoieticCstemCcellsCinCboneCmarrow.CStemCellsDevC20：933-946,C2011＊＊＊