あたらしい眼科

886（13あ4）たらしい眼科Vol.28，No.6，20110910-1810/11/\100/頁/JC（O0P0Y）《原著》あたらしい眼科28（6）：886.890，2011c〔別刷請求先〕井上順：〒216-8511川崎市宮前区菅生2-16-1聖マリアンナ医科大学眼科学教室Reprintrequests：JunInoue,M.D.,DepartmentofOphthalmology,St.MariannaUniversitySchoolofMedicine,2-16-1Sugao,Miyamae-ku,Kawasaki-shi,Kanagawa216-8511,JAPANプロスタグランジン関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する影響井上順＊1岡美佳子＊2井上恵理＊1徳田直人＊1竹鼻眞＊2上野聰樹＊1＊1聖マリアンナ医科大学眼科学教室＊2慶應義塾大学薬学部分子機能生理学講座EffectofProstaglandinAnaloguesonRabbitCornealEpithelialCellsJunInoue1）,MikakoOka2）,EriInoue1）,NaotoTokuda1）,MakotoTakehana2）andSatokiUeno1）1）DepartmentofOphthalmology,St.MariannaUniversitySchoolofMedicine,2）DepartmentofMolecularFunctionandPhysiology,KeioUniversityFacultyofPharmacyプロスタグランジン（PG）関連薬の角膜への影響を検討するため，ウサギ角膜上皮細胞を用いて細胞毒性および細胞増殖に対する抑制作用を比較した．96ウェルプレートにウサギ角膜上皮細胞を5,000cells/mlで播種し，24時間培養後2倍希釈系列（2.512倍）になるように希釈したPG関連薬（ラタノプロスト0.005％，トラボプロスト0.004％，タフルプロスト0.0015％，ビマトプロスト0.03％）を各ウェルに分注し，一定時間培養後LDH（lactatedehydrogenase）assay法またはMTT〔3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide〕assay法を行い，各薬剤の細胞障害率および細胞増殖抑制率を算出した．薬剤濃度を横軸に，細胞増殖抑制率または細胞障害率を縦軸にとり近似曲線を求めた．LDHassay法による細胞障害率50％となる希釈濃度はラタノプロスト（12.2倍）＞タフルプロスト（7.1倍）＞ビマトプロスト（3.7倍）＞トラボプロスト（1.2倍）の順で高く，MTTassay法による細胞増殖抑制率50％となる希釈濃度はラタノプロスト（25.5倍）＞タフルプロスト（21.8倍）＞ビマトプロスト（10.6倍）＞トラボプロスト（1.1倍）の順で高かった．培養ウサギ角膜上皮細胞に対する影響はラタノプロスト，タフルプロスト，ビマトプロスト，トラボプロストの順で強かった．Thecytotoxicityandinhibitoryeffectsofvariousprostaglandin（PG）analogueeyedropsoncornealepithelialcellgrowthwerecomparedinculturedrabbitcornealepithelialcells.Thecellswerespreadona96-wellplate.Afterincubation,thePGanalogues（0.005％latanoprost,0.004％travoprost,0.0015％tafluprost,and0.03％bimatoprost）weredilutedtoprepareserial2-folddilutions（2-512fold）,andeachwaspouredintoeachwell.LDH（lactatedehydrogenase）assayor3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide（MTT）assaywereperformed,andthecytotoxicityrateandcellgrowthinhibitionratewerecalculatedforeachdrug.Anapproximatecurvewasobtainedforeachdrugandcomparativeinvestigationwasconductedbyplottingtheconcentrationofeachdrugonthehorizontalaxisandthegrowthinhibitionrateorcytotoxicityrateonthelongitudinalaxis.Thecytotoxicityrate,asdeterminedbyLDHassay,washighest（50％）forthe12.2-folddilutionoflatanoprost,followedinorderbythe7.1-folddilutionoftafluprost,the3.7-folddilutionofbimatoprostandthe1.2-folddilutionoftravoprost.Thegrowthinhibitionrate,asdeterminedbyMTTassay,washighestforthe25.5-folddilutionoflatanoprost,followedinorderbythe21.8-folddilutionoftafluprost,the10.6-folddilutionofbimatoprostandthe1.1-folddilutionoftravoprost.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（6）：886.890,2011〕Keywords：角膜上皮細胞，プロスタグランジン関連薬，LDHassay法，MTTassay法．cornealepithelialcell,prostaglandinanalogues,LDHassay,MTTassay.（135）あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011887はじめに緑内障治療では，一般的にまず点眼薬治療が行われる．現在では多くの抗緑内障点眼薬が登場し，治療の選択肢が増えてきている．そのなかでも，プロスタグランジン（PG）関連薬は強力な眼圧下降効果を有し，しかも全身的な副作用が少ないことから，緑内障薬物療法の第一選択薬となっている．一方，緑内障は疾患の性質上，一度，抗緑内障点眼薬が投与されると長期にわたり投与が継続される場合や，眼圧コントロールを得るために複数の薬剤が同時に併用投与される場合もある．点眼薬が最初に接触するのは角膜，結膜などのオキュラーサーフェスであり，この部位での副作用発現の可能性があり，考慮する必要がある．実際に点眼薬の眼局所副作用として角膜上皮障害が多く報告されており，さらに長期連用により重篤化することもある1）．また，その角膜上皮障害の程度も点眼薬により異なる．この角膜上皮障害は一旦発症すると，点眼治療を中止しなければならない場合や，自覚症状のためにアドヒアランス低下の原因となる場合もあり，治療を行ううえで大きな影響を及ぼす可能性がある．本研究では，PG関連薬の角膜上皮細胞に対する影響について培養ウサギ角膜上皮細胞を用いて，細胞障害性をLDH（lactatedehydrogenase；乳酸脱水素酵素）活性を指標に検討し，さらにはMTT〔3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide〕assay法により，細胞増殖に及ぼす影響について検討した．I実験材料および方法1.実験材料培養細胞は凍結正常ウサギ角膜上皮細胞（NRCE2）（クラボウ），培地はM-StarA（KeratinocyteGrowthMedium）（アルブラスト）を用いた．LDH活性測定には，LDH-細胞毒性テストキット（和光純薬）を使用した．MTTassay法は，MTT（SIGMA）をPBS（phosphate-bufferedsaline）にて最終濃度5mg/mlになるように調製し，呈色液として用いた．MTT溶解液には0.04NHCl-isopropanol液（和光純薬）を用いた．PG関連薬はラタノプロスト0.005％（ファイザー），トラボプロスト0.004％（日本アルコン），タフルプロスト0.0015％（参天製薬），ビマトプロスト0.03％（千寿製薬）の市販製品を使用した2）．いずれも2009年11月に購入したもので，タフルプロストについては2010年1月の防腐剤濃度変更以前のものを用いた（表1）．2.実験方法a.ウサギ角膜上皮細胞の培養法凍結正常ウサギ角膜上皮細胞を60mmペトリディッシュに播種し，37℃インキュベーターで5％CO2の条件下で培養した．細胞がサブコンフルエント（80％）になった時点で，1.0×105cells/mlの細胞浮遊液を作製し，96ウェルプレートに細胞浮遊液50μl（5,000cells/ml）を分注した．各ウェルに培養液を加え全量100μlとした．b.LDH活性の測定96ウェルプレートに播種したウサギ角膜上皮細胞は24時間培養後，培養液で洗浄し，最後に培養液50μlを各ウェルに分注した．各PG関連薬を2倍希釈系列（2.512倍）になるように培養液で希釈したものを各ウェルに50μlずつ分注した．15分間室温で放置後，各ウェルから50μlとり，別のプレートに移し，発色液（ニトロブルーテトラゾリウム）50μlを分注し，45分間室温で放置した．反応停止液（0.04NHCl）100μlを各ウェルに加え，マイクロプレートリーダーを用いて570nm波長の吸光度を測定した．各薬剤とも各希釈濃度について4サンプルずつ吸光度を測定した．検体（S），ネガティブコントロール（NC；PBS），およびポジティブコントロール（PC；PBSで溶解した0.2％Tween20）の平均吸光度から，以下に示す計算式で細胞障害率を算出した．細胞障害率（％）＝（S.N/P.N）×100各PG関連薬の細胞障害作用に有意差があるか否かは，ANOVA（analysisofvariance；分散分析法）検定後，Bonferroni/Dunn法の多重検定を行い，危険率p＜0.05をもって有意差ありとした．50％細胞障害希釈倍率は，各薬剤の濃度を横軸にとり，細胞障害率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし対数の近似曲線を求めることによって算出した．c.細胞増殖抑制率の測定96ウェルプレートを24時間培養後，培養液を取り除き，各PG関連薬をそれぞれ2倍希釈系列（2.512倍）になるように培養液で希釈したものを各ウェルに100μlずつ分注し，48時間培養した．各ウェルにMTT溶液（5mg/ml）10μlを加え，37℃で4時間インキュベートした．MTT溶解溶液100μlを加え，マイクロプレートリーダー（LabsystemsMultiskanMS；Labsystems）を用いて570nm波長の吸光度を測定した．各薬剤とも各希釈濃度について4サンプルずつ吸光度を測定した．薬剤無添加のウェルを対照とし，以下に示す計算式で細胞増殖抑制率を算出した．細胞増殖抑制率（％）＝100.（薬剤添加ウェルの平均吸光度／薬剤無添加ウェルの平均吸光度）×100各PG関連薬の細胞増殖抑制作用に有意差があるか否か表1各種プロスタグランジン関連薬の主剤濃度と防腐剤濃度主剤防腐剤ラタノプロスト0.005％ベンザルコニウム塩化物0.02％トラボプロスト0.004％sofZiaRタフルプロスト0.0015％ベンザルコニウム塩化物0.01％ビマトプロスト0.03％ベンザルコニウム塩化物0.005％888あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011（136）は，ANOVA検定後，Bonferroni/Dunn法の多重検定を行い，危険率p＜0.05をもって有意差ありとした．50％増殖抑制希釈倍率は，各薬剤の濃度を横軸にとり，細胞増殖抑制率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし，対数近似曲線を求めることによって算出した．II結果1.LDH活性の測定LDH検出法を用いて測定した吸光度から細胞障害率を算出し，細胞障害に対するPG関連薬の影響を検討した．Bonferroni/Dunn法による多重検定を行った結果，各薬剤間に有意差は認めなかったが，最も高い細胞障害性を認めたのはラタノプロスト0.005％であり，細胞障害率は2倍希釈で114％，4倍希釈で66％であった．ついでタフルプロスト0.0015％において，2倍希釈で100％，4倍希釈で48％の細胞障害を認めた．ビマトプロスト0.03％の細胞障害率は，2倍希釈で95％，4倍希釈で37％であった．細胞障害性が最も低かったのがトラボプロスト0.004％であり，細胞障害率は2倍希釈で60％と他の3剤と比較し細胞障害率は低値であり，4倍希釈で35％であった．256倍希釈ではいずれの薬剤も細胞障害率は10％以下となり，512倍希釈では，細胞障害はほとんど認めなかった（図1）．各薬剤の濃度を横軸にとり，細胞障害率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし対数近似曲線を求めることによって50％細胞障害希釈倍率を算出した．50％細胞障害時希釈倍率は，ラタノプロスト12.2倍，タフルプロスト7.1倍，ビマトプロスト3.7倍，トラボプロスト1.2倍であった（図2）．2.細胞増殖抑制率の測定MTTassay法を用いて測定した吸光度から細胞増殖抑制率を算出し，細胞増殖に対するPG関連薬の影響を検討した．細胞増殖抑制率は，ラタノプロストにおいて8倍希釈まで80％以上，32倍希釈でも49％であり，いずれの希釈倍率でも最も抑制率は高かった．ついでタフルプロストにおいて，4倍希釈で83％，16倍希釈で65％，32倍希釈で45％と高い細胞増殖抑制率を認めた．ビマトプロストの細胞増殖抑制率は，4倍希釈で72％，16倍希釈で53％，32倍希釈で30％であった．最も低い細胞増殖抑制率を示したのはトラボプロストであり，抑制率は4倍希釈で66％，16倍希釈で35％，32倍希釈で28％となった（図3）．Bonferroni/Dunn法による多重検定を行った結果，トラボプロストは，4倍希釈および8倍希釈濃度で他の薬剤に対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．さらにトラボプロストは，4倍希釈から64倍希釈濃度でラタノプロストに対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示し，16倍希釈160140120100806040200－20512256128643216842希釈濃度（倍）細胞障害率（％）：ラタノプロスト0.005％：タフルプロスト0.0015％：ビマトプロスト0.03％：トラボプロスト0.004％図1PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する細胞障害率の比較LDH検出法を用いて各種薬剤の細胞障害率を算出した．各希釈系列における薬剤間の有意差は認めなかった．細胞障害性はトラボプロスト0.004％が最も低かった．n＝4，平均±標準偏差．希釈濃度（倍）00.10.20.30.40.50.6細胞障害率（％）：ラタノプロスト0.005％（LAT）：タフルプロスト0.0015％（TAF）：ビマトプロスト0.03％（BIM）：トラボプロスト0.004％（TRA）120100806040200LATy＝0.1582Ln（x）＋0.8959TAFy＝0.1458Ln（x）＋0.7855BIMy＝0.1227Ln（x）＋0.6619TRAy＝0.0899Ln（x）＋0.5147図2各種PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞障害率の近似曲線100806040200－20251625612864321684希釈濃度（倍）細胞増殖抑制率（％）＃＃＃＊＊＃＃＃＊＊＃＃＃＊＊＊＃＃＃＃＃＃＃＊＊＊：ラタノプロスト0.005％：タフルプロスト0.0015％：ビマトプロスト0.03％：トラボプロスト0.004％図3PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する細胞増殖抑制率の比較MTTassay法を用いて各種薬剤の細胞増殖抑制率を算出した．ラタノプロスト0.005％で最も強い細胞増殖抑制効果を認めた．細胞増殖抑制効果はトラボプロスト0.004％が最も弱かった．n＝4，平均±標準偏差．#p＜0.05ラタノプロストvsトラボプロスト．＊p＜0.05タフルプロストvsトラボプロスト．##p＜0.05ビマトプロストvsトラボプロスト．＊＊p＜0.05タフルプロストvsラタノプロスト．###p＜0.05ラタノプロストvsビマトプロスト．＊＊＊p＜0.05タフルプロストvsビマトプロスト．（ANOVAおよびBonferroni/Dunn法）（137）あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011889から64倍希釈濃度でタフルプロストに対しても，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．タフルプロストは，32倍希釈濃度でラタノプロストに対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．ビマトプロストは，16倍希釈および32倍希釈濃度でラタノプロストに対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示し，64倍希釈濃度でタフルプロストに対しても，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．各薬剤の希釈濃度を横軸にとり，細胞増殖抑制率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし対数近似曲線を求めることによって50％細胞増殖抑制希釈倍率を算出した．50％増殖抑制希釈倍率は，ラタノプロスト25.5倍，タフルプロスト21.8倍，ビマトプロスト10.6倍，トラボプロスト1.1倍であった（図4）．III考按緑内障の薬物治療は長期にわたることが多い．そのため，眼圧下降効果のみならず，副作用や使用感，経済的負担などを考慮し，患者に応じた最適な薬剤の選択が望まれる．薬剤の選択肢が広がることは，より最適な薬剤処方の実現に寄与するとともに，近年，わが国における薬剤の選択肢は大きな変化を示している．イソプロピルウノプロストン点眼液およびラタノプロスト点眼液が発売されて以降，これらのPG関連薬が薬物治療のおもな第一選択薬として使用されてきた．近年にはトラボプロスト点眼液，タフルプロスト点眼液およびビマトプロスト点眼液が登場し，PG関連薬の選択肢が大きく広がった．さらに最近，一部のPG関連薬とチモロールマレイン酸塩の配合点眼液が発売され，さらに薬剤の選択肢が広がっている．各種のPG関連薬の眼圧下降効果については多くの報告がある3.6）．また，副作用については緑内障患者のアドヒアランスへの影響が大きいとされる結膜充血に関する報告が多い7,8）．その一方で，緑内障患者が角膜疾患を併発しているケースも少なくないなかで，わが国で使用されているPG関連薬を使用した角膜障害性に関する報告はほとんどない．そこで，今回は4種のPG関連薬の角膜障害性についてウサギ角膜上皮細胞を使用して比較検討することにした．本研究では，各種PG関連薬およびその希釈液を使用して，細胞死の指標であるLDHassay法9.11）と細胞増殖の指標であるMTTassay法12）で角膜上皮細胞に対する障害性を調べた．その結果，各種PG関連薬でウサギ角膜上皮細胞に対する影響に差が認められ，さらにLDHassay法およびMTTassay法ともに同様の傾向が認められた．ウサギ角膜上皮細胞に対して最も強い毒性を示したのはラタノプロスト点眼液で，続いてタフルプロスト点眼液，ビマトプロスト点眼液であり，トラボプロスト点眼液はウサギ角膜上皮細胞に対して最も影響が少ない薬剤であることが明らかとなった．点眼薬は主薬のほかに等張化剤，緩衝剤，可溶化剤，安定化剤，防腐剤，粘稠化剤などが含まれており，点眼薬による角膜上皮障害を考えるうえで，これら添加剤の影響も十分に考慮する必要がある．特に防腐剤のなかではベンザルコニウム塩化物（benzalkoniumchloride：BAK）による角膜上皮障害については多くの報告があり13.16），今後，抗緑内障点眼薬中の薬効成分以外の成分に関する検討も必要であると考えられる．各種PG関連薬の主薬の細胞障害性については，Guenounらがヒト結膜上皮細胞を使用した結果を報告している17）．その結果では，ラタノプロスト，トラボプロスト，ビマトプロストの順で障害性が高かったことを示している（タフルプロストは非使用）．本研究に用いたPG関連薬に含まれる主薬の濃度は，ビマトプロスト：0.03％，ラタノプロスト：0.005％，トラボプロスト：0.004％，タフルプロスト：0.0015％の順で高いが，BAKを含まないトラボプロストが最も細胞毒性が少なく，BAKを含む薬剤のなかでは主薬の濃度が最も高いビマトプロストが最も細胞毒性が少なかった．Guenounらの主薬の細胞障害性の報告と，今回筆者らが実施した製剤の細胞障害性の結果が相関しなかった理由については，BAKの影響が少なからず関与している可能性があると考えられた．BAKは陽イオン界面活性剤であり，その作用は細菌の細胞膜を溶解し，細胞質の変成を起こすことである．本研究で用いたわが国で発売となっているPG関連薬のなかで，BAKを含有するものは，ラタノプロスト点眼液，タフルプロスト点眼液，ビマトプロスト点眼液であり，BAKの含有量2）はラタノプロスト点眼液が0.02％，タフルプロスト点眼液は0.01％，ビマトプロスト点眼液は0.005％と報告されている．一方，トラボプロスト点眼液に含まれる防腐剤はsofZiaRである．sofZiaRはホウ酸/ソルビトール存在下で塩希釈濃度（倍）0.10.20.30.40.50.6細胞障害率（％）100806040200－20：ラタノプロスト0.005％（LAT）：タフルプロスト0.0015％（TAF）：ビマトプロスト0.03％（BIM）：トラボプロスト0.004％（TRA）LATy＝0.1721Ln（x）＋1.0575TAFy＝0.157Ln（x）＋0.9837BIMy＝0.1466Ln（x）＋0.8467TRAy＝0.1112Ln（x）＋0.5078図4各種PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞増殖抑制率の近似曲線890あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011（138）化亜鉛が保存効果を示す防腐剤であり，BAKよりも細胞障害性が低いことが報告されている18.21）．今回の筆者らの結果では，製剤の細胞障害性がトラボプロスト点眼液を除くとBAKの含有濃度に依存すること，また既報のとおりBAKよりもsofZiaRが細胞障害性を誘発しにくいことが示唆された．以上，各種PG関連薬についてinvitroでウサギ角膜上皮細胞障害性について検討した．実際の臨床では個々の症例について，涙液動態，角膜知覚，糖尿病などの基礎疾患を併発する場合など，角膜および点眼薬にまつわる環境はさまざまであり，薬剤そのものの細胞障害性だけでは副作用の発現を予測できない場合もある．しかし，本研究のモデルは，PG関連薬の臨床で用いられている製品を，ウサギ角膜上皮細胞に接触させたときの細胞障害性を比較したものであり，各薬剤の細胞障害性のポテンシャルを把握するうえでは有用であると考える．ただし，本試験系では製剤中の主薬および添加物の代謝などの要因が加味されないため，実際の緑内障患者における点眼時の各々の眼表面の挙動とは相違すること，さらにタフルプロスト点眼液が最近，BAKの濃度を低減していることも併せて考慮する必要がある．緑内障治療は，その患者にとってほぼ生涯にわたり治療が継続されることが多いことから，各点眼薬の特性，眼圧下降効果および副作用などを十分理解したうえで，その患者に最も適した薬剤を選択することは不可欠である．そのことが患者のアドヒアランスの向上に繋がり，継続可能でより効果的な治療が行えることになるであろうと考える．文献1）HerrerasJM,PastorJC,CalongeMetal：Ocularsurfacealterationafterlong-termtreatmentwithanantiglaucomatousdrug.Ophthalmology99：1082-1088,19922）青山裕美子：緑内障点眼薬の基剤と防腐剤．臨眼63（増刊）：252-259,20093）ChengJW,CaiJP,LiYetal：Ameta-analysisoftopicalprostaglandinanalogsinthetreatmentofchronicangleclosureglaucoma.JGlaucoma18：653-657,20094）ParrishRK,PalmbergP,SheuWP：Acomparisonoflatanoprost,bimatoprost,andtravoprostinpatientswithelevatedintraocularpressure：A12-week,randomized,masked-evaluatormulticenterstudy.AmJOphthalmol135：688-703,20035）StewartWC,KonstasAGP,NelsonLAetal：Meta-analysisof24-hourintraocularpressurestudiesevaluatingtheefficacyofglaucomamedicines.Ophthalmology115：1117-1122,20086）OrzalesiN,RossettiL,BottoliAetal：Comparisonoftheeffectsoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostoncircadianintraocularpressureinpatientswithglaucomaorocularhypertension.Ophthalmology113：239-246,20067）AptelF,CucheratM,DenisP：Efficacyandtolerabilityofprostaglandinanalogs：ameta-analysisofrandomizedcontrolledclinicaltrials.JGlaucoma17：667-673,20088）EyawoO,NachegaJ,LefebvrePetal：Efficacyandsafetyofprostaglandinanaloguesinpatientswithpredominantlyprimaryopen-angleglaucomaorocularhypertension：ameta-analysis.ClinOphthalmol3：447-456,20099）DeckerT,Lohmann-MatthesML：Aquickandsimplemethodforthequantitationoflactatedehydrogenasereleaseinmeasurementsofcellularcytotoxicityandtumornecrosisfactor（TNF）activity.JImmunolMethods115：61-69,198810）KorzeniewskiC,CallewaertDM：Anenzyme-releaseassayfornaturalcytotoxicity.JImmunolMethods64：313-320,198311）MurphyTH,MaloufAT,SastreAetal：Calcium-dependentglutamatecytotoxicityinaneuronalcellline.BrainRes444：325-332,198812）HansenMB,NielsenSE,BergK：Re-examinationandfurtherdevelopmentofapreciseandrapiddyemethodformeasuringcellgrowth/cellkill.JImmunolMethods119：203-210,198913）PfisterRR,BursteinN：Theeffectsofophthalmicdrugs,vehicles,andpreservativesoncornealepithelium：ascanningelectronmicroscopestudy.InvestOphthalmolVisSci15：246-259,197614）BursteinNL,KlyceSD：Electrophysiologicandmorphologiceffectsofophthalmicpreparationsonrabbitcorneaepithelium.InvestOphthalmolVisSci16：899-911,197715）LiangH,BaudouinC,FaureMOetal：Comparisonoftheoculartolerabilityofalatanoprostcationicemulsionversusconventionalformulationsofprostaglandins：aninvivotoxicityassay.MolVis15：1690-1699,200916）WhitsonJT,CavanaghHD,LakshmanNetal：Assessmentofcornealepithelialintegrityafteracuteexposuretoocularhypotensiveagentspreservedwithandwithoutbenzalkoniumchloride.AdvTher23：663-671,200617）GuenounJM,BaudouinC,RatPetal：Invitrostudyofinflammatorypotentialandtoxicityprofileoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostinconjunctiva-derivedepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci46：2444-2450,200518）HorsleyMB,KahookMY：Effectsofprostaglandinanalogtherapyontheocularsurfaceofglaucomapatients.ClinOphthalmol3：291-295,200919）KahookMY,NoeckerRJ：ComparisonofcornealandconjunctivalchangesafterdosingoftravoprostpreservedwithsofZia,latanoprostwith0.02％benzalkoniumchloride,andpreservative-freeartificialtears.Cornea27：339-343,200820）YeeRW,NorcomEG,ZhaoXC：Comparisonoftherelativetoxicityoftravoprost0.004％withoutbenzalkoniumchlorideandlatanoprost0.005％inanimmortalizedhumancorneaepitherialcellculturesystem.AdvTher23：511-519,200621）BaudouinC,RianchoL,WarnetJMetal：Invitrostudyofantiglaucomatousprostaglandinanalogues：travoprostwithandwithoutbenzalkoniumchlorideandpreservedlatanoprost.InvestOphthalmolVisSci48：4123-4128,2007