《原著》あたらしい眼科38（3）：337.341，2021cアデノウイルスベクターを用いた角結膜感染モデルマウス作製の試み福田理子＊1島田勝＊2伊藤沙織＊1宮永嘉隆＊3川添賢志＊3河越龍方＊4奥田研爾＊2水木信久＊1＊1横浜市立大学眼科学教室＊2横浜市立大学微生物学・分子生体防御学教室＊3西葛西井上眼科＊4亀田総合病院眼科CPreparationofaKeratoconjunctivalInfectionMouseModelusingAdenovirusVectorMichikoFukuda1）,MasaruShimada2）,SaoriItoh1）,YoshitakaMiyanaga3）,TakashiKawazoe3）,TatsukataKawagoe4）,KenjiOkuda2）andNobuhisaMizuki1）1）DepratmentofOphthalmologyandVisualScience,YokohamaCityUniversity,2）DepartmentofMicrobiology,YokohamaCityUniversity,3）Nishi-KasaiInoueOphthalmologicalClinic,4）DepartmentofOphthalmology,KamedaMedicalCenterC目的：マウスの眼にアデノウイルス（Ad）ベクターを接種し，角結膜への取り込みと免疫誘導について評価する．方法：蛍光遺伝子を発現するC5型CAdベクターをマウスに点眼し，角結膜への遺伝子導入の有無を評価した．また，AdベクターをマウスにC2回C2週おきに点眼したのち，血清および眼表面洗浄液中のCAd特異的CIgG，IgA抗体価をELISA法で測定した．その後ルシフェラーゼ発現CAdベクターをマウス眼に点眼し，角結膜におけるルシフェラーゼ活性を測定した．結果：Adベクターのマウス角結膜への遺伝子導入を確認した．Adベクターを点眼したマウスでは血清，眼表面洗浄液ともにCAd特異的CIgG，IgA抗体価の上昇を認めた．また，Adベクターの角結膜への遺伝子導入が阻害された．結論：点眼によるマウス角結膜へのCAd遺伝子導入の実験方法を確立した．点眼によりCAdの角結膜への遺伝子導入が阻害され，ワクチンとしての可能性が示された．CPurpose：ToCinoculateCmouseCeyesCwithCanadenovirus（Ad）vectorCandCevaluateCgeneCtransductionCintoCtheCkeratoconjunctivaCandCimmunityCinduction.CMethods：AC.uorescentCgene-expressingCAdCvectorCeye-dropCwasCadministeredtomiceeyes.AftertheAd-vectoreye-dropimmunizationtothemice,Ad-speci.cIgGandIgAanti-bodiesfromserumandeye-washsolutionweremeasuredbyELISA.Theimmunemicewerethenchallengedwithluciferase-expressingCAdCvectorCinCeye-dropCform,CfollowedCbyCquali.cationCofCluciferaseCactivityCinCtheCeyes.CResults：OurC.ndingsCcon.rmedCthatCAdCvectorCcanCbeCtransductedCtoCtheCcorneaCandCconjunctiva,CandCthatCAd-speci.cIgGandIgAinbothserumandeye-washsolutioncanbeinducedbyAd-vectoreyedrops.Moreover,theCtransductionCofCluciferase-expressingCAdCvectorCwasCgreatlyCinhibitedCinCtheCimmuneCmice.CConclusions：WeestablishedCanCexperimentalCmethodCforCAdCgeneCtransductionCintoCtheCkeratoconjunctivaCofCmiceCviaCeyeCdrops.CThetransductionofAdvectortothecorneaandconjunctivawasinhibitedbyAd-vectoreyedrops,thusindicat-ingtheirpossiblepotentialforuseasavaccine.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）C38（3）：337.341,C2021〕Keywords：アデノウイルス角結膜炎，点眼ワクチン，遺伝子導入．adenoviruskeratoconjunctivitis,eyedropvaccination,genetransduction.Cはじめに炎の原因としても同定された2）．アデノウイルスは複数の血ヒトアデノウイルスは流行性角結膜炎や咽頭結膜熱といっ清型が同定されており，結膜炎の原因としてはC8，19，37た結膜炎を引き起こす．1952年CHillemanらによって感冒の型が広く知られているが，3，4，7，11，14型も報告があが原因として初めてアデノウイルスが報告され1），その後結膜っている．最近では全遺伝子配列のバイオインフォマティク〔別刷請求先〕福田理子：〒143-0023東京都大田区山王C4-21-17Reprintrequests：MichikoFukuda,4-21-17Sanno,Ota-ku,Tokyo143-0023,JAPANC0910-1810/21/\100/頁/JCOPY（99）C337ス解析による遺伝子型が定義されており，53，54，56型によるアウトブレイクが報告されている．アデノウイルス角結膜炎は感染力が非常に強く，おもに接触で感染する．集団で大規模感染を起こし学級閉鎖にもなるため，学校保健安全法ではアデノウイルス角結膜炎は出席停止の対象疾患とされている．成人においても大規模感染を引き起こすために，医療施設や福祉施設で業務制限，出勤停止を定めているところもある．臨床上重要な疾患であるにもかかわらず，最初の報告から60年以上経過した現在に至るまで，アデノウイルス角結膜炎に対する有効な治療法やワクチンは確立されていない．その原因の一つがアデノウイルスの種特異性の高さである3,4）．アデノウイルス科は哺乳類アデノウイルスとトリアデノウイルスのC2属に分けられる．ヒト以外の哺乳類アデノウイルスとしてサル，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，イヌ，マウスなどのアデノウイルスが知られており，感染臓器や呈する所見，疾患は種によって異なる．一部動物において，ヒトアデノウイルス遺伝子の発現や，角膜上皮下浸潤といった角膜所見が観察されているが，いずれもウイルス接種の方法は外科的手技によるものであり，また現在に至るまで適切なモデル動物は作製されていない．筆者らは今回，眼表面局所での感染防御能を明らかにすべく，またアデノウイルス角結膜炎に対するワクチン開発をめざし，点眼によるアデノウイルス眼感染モデルマウスの作製を試みた．また，アデノウイルスを点眼で投与した場合の免疫誘導とその感染防御能について評価した．CI材料および方法1.実験動物とアデノウイルスベクター実験動物として，8週齢メスのCBALB/Cマウスを使用した．レポーター蛋白質で標識したC5型CAdベクター（Ad5-GFP，Ad5-mCherryおよびCAd5-luciferase）は，いずれも増殖に必要なCE1およびCE3領域を除去している5）．これらアデノウイルスベクターをCHEK293細胞中で増殖させ，10mMトリスバッファー（pH7.5），1CmMMgCl2，およびC10％グリセロールを含む溶液で，CsClによる等密勾配遠心分離により精製した．各調製物中のウイルスの濃度は，260Cnmでの吸光度（OD）についてC1OD260＝1×1012vectorgenomes（vg）/mlとして計算した．C2.マウス角結膜へのヒト5型アデノウイルス接種Ad5-mCherryをマウスC1眼につきC10C10vg点眼した．点眼後C1.5日目に連日マウスの眼球を摘出し，それぞれ蛍光顕微鏡下で直接観察した．別のマウスに，Ad5-luciferaseをC1眼につきC10C10vg点眼し，点眼後C1.5日目に連日マウスの眼球を摘出してCPBSで洗浄し，水晶体を除去した後CLysisCBu.er300Cμlとともに1.5Cmlエッペンドルフチューブに入れ，ホモジネートした．得られた細胞溶解液をC8,000CgでC10分間遠心分離したのち，上清C4Cμlをルシフェラーゼアッセイ基質C20Cμlと混合し，ルミノメーターでルシフェラーゼ活性を測定した．C3.免疫誘導および角結膜感染に対する感染防御能の評価0日およびC2週目に，マウス各眼に対しCAd5-GFPをC1C×1010vg点眼した．コントロール群マウスには同量のCPBSを点眼した．最初の点眼からC5週目に尾静脈から血液を採取し，血清を分離した．また，同じくC5週目にマウスC1眼につきプロテインインヒビターを混合したCPBS40Cμlで眼表面を20回ピペッティングし，洗浄液を回収した．採取した血清と眼表面洗浄液中のCAd5特異的CIgGおよびCIgAの抗体価を，それぞれCELISA法で測定した．ELISA法ではCAd5-GFPでコーティングしたC96ウェルマイクロプレートを用い，HRP標識された二次抗体を用いた間接法で測定した．サンプルである血清や眼表面洗浄液は連続C2倍希釈した．o-フェニレンジアミンジヒドロクロリドを基質として加え，450Cnmでの吸光度を測定し，希釈倍率C2のCx乗倍で吸光度＜0.2となったときのC2のCx乗の最大値を抗体価とした．さらに，マウス1眼に対しCAd5-luciferaseC1010vgを点眼し，3日後に全眼球を摘出し，ホモジネートしてルシフェラーゼ活性を測定した．CII結果Adをマウス眼に感染させたところ，Ad5-mCherry点眼後C1からC5日目のマウス眼すべてにおいて，角結膜で橙色の蛍光を確認した．また，3日目のマウス眼でもっとも強く広範囲に蛍光を認めた（図1）．Ad5-luciferaseを点眼したマウス眼球から作製した細胞溶解液では，点眼後C1日目から経時的にルシフェラーゼ活性が上昇し，点眼後C3日目をピークとしてその後低下した（datanotshown）．以上より，ルシフェラーゼ活性の測定はCAd5-luciferase点眼後C3日目に実施することとした．Ad5-GFPを点眼後C7週目のマウス血清において，Ad5特異的CIgGおよびCIgAの抗体力価はCIgG抗体力価C2のC13.2乗，IgA抗体力価C2のC8.6乗といずれも上昇していた．血清CIgGおよびCIgAの抗体力価はともに有意差があった．また，点眼後C7週目の眼表面洗浄液においても，Ad5特異的CIgGおよびCIgAの抗体力価はCIgG抗体力価C2のC8.4乗，IgA抗体力価C2のC7.6乗といずれも上昇していたが，有意差は認めなかった（図2）．事前にCAd5-GFPをC2回点眼した群とCPBSを点眼したコントロール群において，その後CAd5-luciferaseを点眼後C3日目の眼球におけるルシフェラーゼ活性は，コントロール群をC1とした場合，Ad5-GFPを点眼したマウスではC0.115と有意に低下していた（図3）．図1Ad5.mCherry点眼後の蛍光顕微鏡像各日C3匹，合計C18匹のマウスを使用した．点眼後C1.5日すべてにおいて角結膜に橙色の蛍光を認めた．C2抗体力価（log2）1510血清眼洗浄液血清眼洗浄液図2Ad5特異的IgGおよびIgA抗体価各グループC5匹のマウスを使用し，Mann-WhitneyのCU検定で有意差を検定した．点眼で免疫誘導した群では血清，眼表面洗浄液ともにCAd5特異的CIgGおよびCIgA抗体価の上昇を認めた．CIII考按Ad角結膜炎は自然治癒する疾患であるが，罹患後角膜混濁を残す場合には羞明や視力低下により患者のCQOLは低下する．そのため，感染そのもの，感染拡大を防止することが必要である．C57BL/6Jマウスの角膜にマイクロインジェクション法でヒトCAd37型を接種した研究では，接種後角膜間質混濁と炎症，ウイルス複製初期に関与するCmRNAの発現を認めた6）．また，25ゲージ針でウサギの角膜に傷をつけ，アデノウイルス角結膜炎患者から分離したCAd5を接種した研究では，ヒト類似の遅発性上皮下浸潤が報告されている7）．対照群免疫群相対ルシフェラーゼ活性1.81.61.41.210.80.60.40.20図3点眼による角結膜感染防御3回の実験のうちC1回の結果を提示する．点眼で免疫誘導した群でルシフェラーゼ活性の低下を認めた．ほかのC2回の結果も同様の結果を示した．各グループC5匹のマウスを使用し，Mann-WhitneyのCU検定で有意差を検定した．ほかにも動物実験の報告はいくつか存在するが8），現時点で確立されたアデノウイルス角結膜炎の動物モデルは存在せず，またいずれもウイルスの接種方法は外科的手技によるもので，自然な感染経路とは大きく異なる．筆者らは今回，Ad5ベクターを用いて実験を行った．角結膜炎を引き起こすアデノウイルスの血清型はほとんどがCD群のウイルスであり，5型CAdはヒトでもマウスでも角結膜炎の原因とはならない．また，今回用いたCAd5ベクターは増殖に必要な領域を除去しているため，ウイルス増殖や疾患発症の抑制については評価できない．しかし，Ad5ベクターは研究や臨床に広く用いられ安定して入手可能であり，遺対照群免疫群伝子操作や導入方法などが十分に確立されている点から，実験方法の確立には適していると判断した．Ad5-mCherryを点眼したマウスの角結膜のみが蛍光を呈していたことは，Ad5-mCherryがマイクロインジェクションや針などの外科的手技を用いず点眼という簡便な接種方法でマウス角結膜細胞内に取り込まれ，蛍光蛋白遺伝子を発現したことを示している．同様にCAd5-Luciferaseも，点眼によりマウスの角結膜に取り込まれ，ルシフェラーゼ遺伝子を発現したと考えられる．このルシフェラーゼ活性を測定することで感染の初期段階であるC5型CAdの角結膜への導入を定量的に評価し，免疫誘導による防御能を比較検討することは可能である．Adを点眼したマウスにおいて，その後CAd5-luciferase点眼をした際のルシフェラーゼ活性が低下していた．このことはCAdにより免疫誘導が起こり，その結果CAdの再定着が抑制されたことを示している．血清および眼表面洗浄液中の特異的CIgAおよびCIgGが有意に上昇していたことがこの防御に関与している可能性が考えられる．IgG抗体価がCIgA抗体価よりも有意に高値であり，眼粘膜免疫ではCIgGの関与も大きいのではないかと示唆される．粘膜上では，粘膜関連リンパ組織（mucosa-associatedClymphoidtissure：MALT）が免疫で重要な機能を果たしており9），NagatakeらはCMALTの内涙.に存在する涙道関連リンパ組織（tearduct-associatedlymphoidtissue：TALT）が前眼部における抗原特異的な免疫に関与していると述べている10）．また，マウスの瞬膜とよばれる眼組織には結膜関連リンパ組織（conjunctiva-associatedClymphoidtissue：CALT）が存在しており，M細胞が点眼した抗原を取り込むことも報告されている11）．今回眼表面洗浄液中に産生されたIgAは，これらのリンパ組織を介して分泌されたと考えられる．粘膜表面に分泌される分泌型CIgAは交差防御能が高く，ワクチン株と流行株の抗原性に差異が生じた場合も有効性が期待できる．遺伝子変異を起こしやすいインフルエンザウイルスについては，この交差防御能が期待できる経鼻ワクチンが注目されている．Adについてもこの交差防御能により，一度のワクチン投与で角結膜炎の原因となる複数の型に対して効果を発揮することが期待できるのではないかと考えられる．一方で，耳鼻咽喉科領域においては細菌やウイルスによる感染が慢性化して生じる慢性副鼻腔炎患者の鼻汁中にはIgA，IgGがともに正常者の鼻汁中よりも増加していることが報告されており12,13），鼻粘膜では眼表面における粘膜防御同様にCIgAだけでなくCIgGも重要な役割を果たしていることが考えられる．Seoらの報告11）では，インフルエンザウイルスCH1N1をマウスに点眼投与することで，同じ粘膜である呼吸器の感染が予防され，点眼ワクチンの肺におけるインフルエンザ発症を抑制する有効性が示されている．インフルエンザウイルスと同様に，Adにおいても点眼により眼局所の感染予防だけでなく，重症肺炎を引き起こすCAdの予防にも効果がある可能性があり，今後の研究が望まれる．また，誘導されたCIgA交差防御能の可能性についても，どの型のCAdが別のどの型のCAdを抑制しうるかに関しても検討していく必要がある．今回の実験で点眼による免疫誘導で角結膜でのC5型CAd遺伝子導入が防御できる可能性が示唆された．ワクチンの投与方法として，皮下注射と比較して点眼は投与方法が簡便であるという利点があり，小児患者の多いCAd角結膜炎対策としては適しているといえる．今後はC8，19，37型などヒトで角結膜炎の原因となる他の型のCAdについてもルシフェラーゼ発現遺伝子を組み込み，同様に防御能を評価していきたい．また，マウス以外の種に関しても検討していきたい．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）GinsbergHS：TheClifeCandCtimesCofCadenoviruses.CAdVi-rusResC54：1-13,C19992）JavetsE,KimuraS,NicholasANetal：NewtypeofAPCvirusCfromCepidemicCkeratoconjunctivitis.CScienceC122：C1190-1191,C19553）JoglerCC,CHo.mannCD,CTheegartenCDCetal：ReplicationCpropertiesofhumanadenovirusinvivoCandinculturesofprimaryCcellsCfromCdi.erentCanimalCspecies.CJCVirolC80：C3549-3558,C20064）RamkeCM,CLamCE,CMeyerCMCetal：PorcineCcornealCcellCculturemodelsforstudyingepidemickeratoconjunctivitis.MolVisC19：614-622,C20135）ShojiCM,CYoshizakiCS,CMizuguchiCHCetal：ImmunogenicCcomparisonCofCchimericCadenovirusC5/35CvectorCcarryingCoptimizedChumanCimmunode.ciencyCvirusCcladeCCCgenesCandvariouspromoters.PLoSOneC7：e30302,C20126）AshishVC,RogerA,JamesC：AdenovirusType37Ker-atitisCinCtheCC57BL/6JCMouse.CInvestCOphthalmolCVisCSciC48：781-788,C20077）GordonCYJ,CRomanowskiCE,CAraullo-CruzT：AnCocularCmodelCofCadenovirusCtypeC5CinfectionCinCtheCNZCrabbit.CInvestOphthalmolVisSciC33：574-580,C19928）TsaiCJC,CGarlinghouseCG,CMcDonnellCPJCetal：AnCexperi-mentalCanimalCmodelCofCadenovirus-inducedCocularCdis-ease.CTheCcottonCrat.CArchCOphthalmolC110：1167-1170,C19929）清野宏，岡田和也：粘膜免疫システム─生体防御の最前線．日耳鼻C114：843-850,C201110）NagatakeCT,CFukuyamaCS,CKimCDYCetal：Id2-,CRORgt-,CandLTbR-independentinitiationoflymphoidorganogene-sisinocularimmunity.JExpMedC206：2351-2364,C200911）SeoKY,HanSJ,ChaHRetal：Eyemucosa：ane.cientvaccinedeliveryrouteforinducingprotectiveimmunity.JImmunolC185：3610-3619,C2010Cnasalsecretionsofpatientswithallergicrhinitisandchron-12）石川保之：慢性副鼻腔炎と鼻汁中分泌型CIgA,IgG．耳鼻臨CicCrhinosinusitis.CEurCArchCOtorhinolaryngolC265：539-床C83：885-889,C1990C542,C200813）HsinCCH,CShunCCT,CLiuCCMCetal：ImmunoglobulinsCinC＊＊＊