《原著》あたらしい眼科29（4）：536.540，2012c電気生理学的手法を用いたチモロールマレイン酸塩点眼液の角膜上皮障害性の検討中嶋幹郎＊1手嶋無限＊1中嶋弥穂子＊1上松聖典＊2北岡隆＊2＊1長崎大学大学院医歯薬学総合研究科臨床薬学講座＊2同眼科・視覚科学講座EvaluationofCornealEpithelialBarrierBreakdownCausedbyTimololMaleateEyedropsUsinganElectrophysiologicMethodMikiroNakashima1）,MugenTeshima1）,MihokoNNakashima1）,MasafumiUematsu2）andTakashiKitaoka2）1）DepartmentofClinicalPharmacy,2）DepartmentofOphthalmologyandVisualSciences,GraduateSchoolofBiomedicalSciences,NagasakiUniversityドナー相ターンオーバーシステムと家兎角膜を用いた電気生理学的手法により，チモロールマレイン酸塩点眼液の角膜上皮障害性を検討した．塩化ベンザルコニウム（BK）を防腐剤として含有するチモロールマレイン酸塩の3種類の点眼液〔チモプトールR点眼液0.5％，リズモンTGR点眼液0.5％，リズモンTGR点眼液0.5％（BK減量製剤：0.001％BKを含有）〕とBK以外の防腐剤を含有する1種類のチモロールマレイン酸塩の点眼液（チモプトールXER点眼液0.5％）を試験薬として用いた．各点眼液を摘出家兎角膜に添加し，ヒト涙液の代謝回転を再現したドナー相ターンオーバーシステムを用いた電気生理学的手法により，角膜表面の経上皮電気抵抗（TEER）の変化を測定した．点眼液の角膜上皮障害性はTEERの低下を指標として評価した．その結果，点眼液添加後の角膜TEERの低下は，防腐剤のBK濃度に依存し，リズモンTGR点眼液0.5％（BK減量製剤：0.001％BKを含有）添加後の値が最も小さかった．また，BK以外の防腐剤を含有する点眼液もBKを含有する点眼液と同様に角膜TEERの低下が認められた．Cornealepithelialdisorderscausedbytimololmaleateeyedropswerereviewedbytheelectrophysiologicmethod,usingadonor-phaseturnoversystemandrabbitcorneas.Usedinthisstudywerethreekindsoftimololmaleateeyedropscontainingbenzalkoniumchloride（BK）asanophthalmicpreservative：TIMOPTOLROphthalmicSolution0.5％,RYSMONTGROphthalmicSolution0.5％andRYSMONTGROphthalmicSolution0.5％（alow-BKpreparationcontaining0.001％BK）,andatimololmaleateeyedropcontaininganophthalmicpreservativeotherthanBK：TIMOPTOLXEROphthalmicSolution0.5％．Eacheyedropswereappliedtoexcisedrabbitcorneas,andchangesintransepithelialelectricalresistance（TEER）inthecornealsurfaceweremonitoredbytheelectrophysiologicmethod,withdonor-phaseturnoversystem,tomimichumantearturnover.CornealepithelialdisorderscausedbytheeyedropswereassessedusingTEERdecreaseasanindex.ResultsshowedthattheextentofdecreaseincornealTEERaftereyedropapplicationwasdependentonBKcontent,thedecreasebeingleastafterapplyingRYSMONTGROphthalmicSolution0.5％（alow-BKpreservativecontaining0.001％BK）.TheeyedropcontainingapreservativeotherthanBK,liketheeyedropscontainingBK,alsoshowedadecreaseincornealTEER.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（4）：536.540,2012〕Keywords：角膜上皮障害，防腐剤，塩化ベンザルコニウム，チモロールマレイン酸塩点眼液，電気生理学的手法．cornealepithelialdisorders,preservative,benzalkoniumchloride,timololmaleateeyedrops,electrophysiologicmethod.〔別刷請求先〕中嶋幹郎：〒852-8521長崎市文教町1-14長崎大学大学院医歯薬学総合研究科臨床薬学講座Reprintrequests：MikiroNakashima,DepartmentofClinicalPharmacy,GraduateSchoolofBiomedicalSciences,NagasakiUniversity,1-14Bunkyo-machi,Nagasaki852-8521,JAPAN536536536あたらしい眼科Vol.29，No.4，2012（102）（00）0910-1810/12/\100/頁/JCOPY はじめに緑内障はわが国の失明原因の上位に位置する疾患として知られている．国内で40歳以上の緑内障の有病率は5.0％とされ，300万人近い罹患患者が存在すると推定されている1,2）．緑内障治療は，患者の視機能維持が主目的となり，長期間の点眼液による治療が必要となるため，目に優しく安全に使用できる点眼液の有用性は高い．最近，点眼液に含まれる防腐剤の塩化ベンザルコニウム（以下，BK）によるさまざまな副作用が報告されており，臨床における点眼液治療の問題となっている3）．このBKは角膜表面の上皮層のバリア機能に悪影響を及ぼすことが知られている4）．したがって，点眼液の角膜上皮バリア能に対する影響を検討し，角膜障害性の少ない点眼液を用いた治療を選択することは，患者のQOL（qualityoflife）やアドヒアランス向上のために重要な取り組みといえる．筆者らは，角膜表面の経上皮電気抵抗（TEER）が，点眼液適用時に現れる角膜上皮バリア機能の変化を検出できる感度の高いパラメータであると考え，8種類の抗アレルギー点眼液について摘出角膜を用いた電気生理学的試験と角膜上皮の培養細胞を用いた細胞毒性試験を行ったところ，角膜TEERの低下の程度が角膜上皮の細胞障害性の強度と有意な相関性を示したことから，角膜TEERの低下を指標として角膜上皮障害性を評価できることを報告した5）．最近，緑内障点眼液として汎用されているチモロールマレイン酸塩点眼液では，防腐剤の種類やその添加濃度が異なるゲル化製剤が市販されている．そこで本研究では，筆者らが考案した電気生理学的手法5,6）を用いて，チモロールマレイン酸塩点眼液の各種製剤の角膜上皮障害性を検討し，得られた結果を比較した．I実験材料1.実験動物空調および温度管理を行った個別のケージにて標準実験動物用飼料（ORC4，オリエンタルイースト）で飼育された2.0.2.5kgの雄性日本白色家兎（KBT：JW系，KBTオリエンタル）を用いた．家兎は自由に飼料と水の摂取できる状態で飼育した．なお，すべての実験は，動物の飼育と使用の指針となる原則（DHEWPublication,NIH80-23），動物の研究利用に関するARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmology）決議およびヘルシンキ宣言に従った．2.チモロールマレイン酸塩点眼液の試験薬防腐剤としてBKを含む3種類のチモロールマレイン酸塩点眼液ならびに防腐剤として臭化ベンゾドデシニウムを使用している1種類のチモロールマレイン酸塩点眼液を用いた．チモプトールR点眼液0.5％（防腐剤として0.005％BKを含有）およびチモプトールXER点眼液0.5％（防腐剤として0.012％臭化ベンゾドデシニウムを含有）は参天製薬から入手した．一方，リズモンTGR点眼液0.5％（防腐剤として0.005％BKを含有）およびリズモンTGR点眼液0.5％（BK減量製剤）（防腐剤として0.001％BKを含有）はわかもと製薬から入手した．II実験方法1.電気生理学的手法前報5,6）の方法に準拠し，ドナー相にヒト涙液の代謝回転速度と同じ16％/minのターンオーバーシステムを備えたUssingチャンバーシステム（CHM1，WorldPrecisionInstruments）を用いて実験を行った（図1）．Ussingチャンバーシステムのドナー相とレシーバー相に取り付けたAg/AgCl電極によって電流および電圧の測定を行った．各チャンバーは，グルタチオン重炭酸加リンゲル液7）（以下，GBR）で満たし，95％O2と5％CO2の混合気によって曝気し，37℃に保ったGBRを循環させた．すべての実験は37℃に保ったUssingチャンバーで行った．家兎をペントバルビタールナトリウムの投与により屠殺した後，角膜を摘出し，ゴム製アダプターとO-リングを取り付けたUssingチャンバーのドナー相とレシーバー相の接合部（面積0.53cm2）に装着し，ドナー相とレシーバー相の容量がそれぞれ6mlと7mlとなるようにGBRを加えた．Ag/AgCl電極の電流は自動電圧測定装置（CEZ-9100，日本光電）につなぎ測定した．摘出した角膜の上皮細胞のアピカル側細胞膜とベーサル側細胞膜の電位差（PD）を2対のAg/AgCl電極で測定した．直流電流は1対のAg/AgCl電極（角膜組織と遠位の電極）で測定した．また，ドナー相─角膜─レシーバー相を流れる短絡回路電流（Isc）は0V（ゼロボルト）の状態で測定を行った．角膜TEERは，60秒間隔で10mVのパルス電圧を1秒間かけたときに流れる最大電流量より角膜の単位面積当たりの電気抵抗値として計算した．摘出角膜を実験装置に装着後，80分間プレインキュベーションを行った後，角膜TEERが約1,000W・cm2の定常状態に達した後にドナー相のGBRの半量を試験薬の各種点眼液で置換し，実験を開始した．点眼液をドナー相に添加した後，ドナー相はただちにぺリスタポンプにより新鮮なGBRを0.96ml/min（16％/min）の速度で100分間にわたりターンオーバーさせた．その際，電気生理学的パラメータは5分間隔で100分間測定した．点眼液添加後に低下した角膜TEERを定量的に評価するため，初期値を100％として点眼液添加後の60分間における低下面積を5分間隔で台形法を用いて算出し，その合計を計算した5）．2.統計解析統計学的解析は，分散分析とScheffeの検定により行い危険率は5％未満とした．（103）あたらしい眼科Vol.29，No.4，2012537 チモプトールXE.チモプトール.（0.012％臭化ベンゾドデシニウム）150（0.005％BK）150拡散セルAg/AgCl電極Ussingチャンバーシステム自動電圧測定装置UssingチャンバーシステムぺリスタポンプTEERの変化（％）TEERの変化（％）TEERの変化（％）TEERの変化（％）1005010050080080120160120160時間（分）時間（分）リズモンTG.リズモンTG.（0.005％BK）（0.001％BK）1501005015010050080080120160120160時間（分）時間（分）図2ドナー相の代謝回転を有する電気生理学的実験システムで測定した4種類のチモロールマレイン酸塩点眼液の角膜表面の経上皮電気抵抗（TEER）に与える影響摘出角膜を実験装置に装着80分後の角膜TEER値を100％とし，点眼液添加後のTEER値の変化を測定した．各値は実験3回の平均値±標準誤差を表す．し，製剤改良によりBK濃度が1/5に減量されたリズモン摘出角膜添加試料ドナー相レシーバー相Ag／AgCl電極16％／minターンオーバーぺリスタポンプ直流電流FlowFlow自動電圧測定装置図1電気生理学的実験装置III結果防腐剤としてBKを含む3種類のチモロールマレイン酸塩点眼液ならびに防腐剤として臭化ベンゾドデシニウムを使用している1種類のチモロールマレイン酸塩点眼液の角膜上皮バリア能へ及ぼす影響を調べた結果を図2に示す．チモプトールR点眼液0.5％とリズモンTGR点眼液0.5％では，角膜TEERの低下パターンに違いが認められたものの，ともに不可逆的な角膜TEERの中等度の低下が観察された．しか538あたらしい眼科Vol.29，No.4，2012TGR点眼液0.5％（BK減量製剤：0.001％BKを含有）では，添加直後に一過性の角膜TEERの低下がみられたが，その後角膜TEERは初期値近くにまで回復した．また，BK以外の防腐剤を含有するチモプトールXER点眼液0.5％でも不可逆的な角膜TEERの中等度の低下が観察された．そこで，各種点眼液の角膜TEERの添加直後から初期の60分間における低下面積を算出した．算出結果はチモプトールR点眼液0.5％（1,921±137％・min），リズモンTGR点眼液0.5％（1,742±579％・min），チモプトールXER点眼液0.5％（1,412±639％・min），リズモンTGR点眼液0.5％（BK減量製剤：0.001％BKを含有）（1,269±651％・min）の順で，試験薬のなかではチモプトールR点眼液0.5％の角膜TEER低下面積が最も大きく，それに比べてリズモンTGR点眼液0.5％（BK減量製剤：0.001％BKを含有）の値は有意に小さかった（p＜0.05）．IV考按角膜は，点眼液が眼球を透過する際の主要な経路である．角膜上皮のうち，表層上皮細胞の間の頂端側タイトジャンクションが傍細胞経路を通過する際の拡散に対する強い抵抗を生じ，親水性薬物が傍細胞経路を通過するのを制限している．上皮組織の傍細胞経路は，通常，電気生理学的パラメー（104） タによる評価が可能である．一般的に，角膜TEERは，上皮組織の傍細胞経路の透過性により生じる変化に最も感受性が高い8）．Rojanasakulら9）は，家兎の各組織の上皮細胞についてTEERを比較し，他の組織と比べて角膜上皮細胞は互いに非常に緊密な結合組織であることを報告している．その報告でのTEERは以下のとおりであった．皮膚（9,703W・cm2）＞口腔（1,803W・cm2）＞角膜（1,012W・cm2）＞直腸（406W・cm2）＞腟（372W・cm2）＞気管（291W・cm2）＞気管支（266W・cm2）＞鼻（261W・cm2）＞小腸（211W・cm2）．この報告での角膜TEERの値は，筆者らの前報の結果5）とほぼ一致している．筆者らは角膜TEERの低下を指標として角膜上皮障害性を評価できる新しい評価系を報告した5）が，一方，BursteinとKlyce10）は，点眼液によって角膜TEERが低下する程度が，角膜上皮の形態学的な障害度を示すことを明らかにしている．ヒトの結膜.に保持されている涙液は通常7μlであるが，その16％が1分間に入れ替わると報告されており，この涙液の代謝回転により，点眼液は点眼後速やかに外眼部から排出される11）．Ussingチャンバーシステムを用いた今回の実験方法では，ヒト涙液の代謝回転を考慮し，ドナー相の溶液がぺリスタポンプにより16％/minの交換率でGBRを灌流して実際に点眼した状態のクリアランスを再現している．この方法により，4種類のチモロールマレイン酸塩点眼液の角膜上皮に対する影響を検討した結果，角膜TEERの低下はBKの濃度変化に依存することが示された．また，臭化ベンゾドデシニウムを含有する点眼液も，BKを含有する点眼液と同様に角膜TEERが低下することがわかった（図2）．BKは，静菌性と殺菌性の作用があるため，眼科用保存剤として市販点眼液に0.001.0.02％の濃度で広く使用されている．しかし，その一方で角膜上皮障害など眼組織への影響が懸念されている12）．筆者らは，Ussingチャンバーのドナー相ターンオーバーシステムによる電気生理学的手法を用いて摘出家兎角膜の電気生理学的特性を測定し，キサラタンR点眼液0.005％（0.02％BK含有0.005％ラタノプロスト点眼液）が角膜TEERを不可逆的に大きく低下させることを明らかにした13）．また，そのなかで角膜TEERが，0.005％ラタノプロストのみを添加しただけでは変化しないものの，0.02％BKを添加すると不可逆的に大きく低下することを示した．近年，福田らは，角膜抵抗測定装置を用いて家兎生体眼に対する4種類のプロスタグランジン点眼液の角膜障害性を検討し，BK添加濃度が高いキサラタンR点眼液の角膜障害性が最も高かったことを報告している14）．Wangらは，家兎角膜上皮の培養細胞を用いて，レスキュラR点眼液0.12％（0.01％BK含有0.12％イソプロピルウノプロストン点眼液）の添加が角膜バリア機能を障害することに加え，0.12％イソプロピルウノプロストンのみではバリア機能に障害を与え（105）ないことを報告している15）．したがって，キサラタンR点眼液0.005％およびレスキュラR点眼液0.12％による角膜TEERの低下は，点眼液に含有される高いBK濃度（0.01.0.02％）が影響した可能性が考えられる．今回の検討の結果，BK添加濃度を0.001％に大きく減量したリズモンTGR点眼液0.5％（BK減量製剤）では，BKを0.005％含有する他の2製剤に比べて角膜TEERの低下率が少なかったが，これはBKの角膜に対する影響が軽減されていることを示す結果である．本研究では，BK添加濃度が同じ0.005％のチモプトールR点眼液0.5％とリズモンTGR点眼液0.5％で角膜TEERの低下パターンに違いが認められた．これは点眼液に含まれるBK以外の添加剤により，角膜TEERの変化が影響を受けることを示唆している．また，BK以外の防腐剤を含有するチモプトールXER点眼液0.5％もBKを0.005％含有する2製剤と同程度の角膜TEERの低下を認めた．筆者らが抗アレルギー点眼液の角膜TEERに対する影響を検討した結果では，防腐剤にクロロブタノールとパラベン類（パラオキシ安息香酸エステルの総称）を含有するゼペリンR点眼液0.1％では，角膜TEERの低下はわずかであったことから5），BK以外の防腐剤でも，その種類により角膜上皮バリア機能に対する影響が異なることが示唆された．以上の結果から，ドナー相ターンオーバーシステムと家兎角膜を用いた電気生理学的手法により観察された角膜TEERの変化は，点眼液によって生じる角膜上皮障害を予測する指標として有用であると考える．文献1）IwaseA,SuzukiY,AraieMetal：TheTajimiStudy,Theprevalenceofprimaryopen-angleglaucomainJapanese.Ophthalmology111：1641-1648,20042）YamamotoT,IwaseA,AraieMetal：TheTajimiStudyreport2,PrevalenceofprimaryangleclosureandsecondaryglaucomainaJapanesepopulation.Ophthalmology112：1661-1669,20053）BaudouinC：Detrimentaleffectofpreservativesineyedrops：implicationsforthetreatmentofglaucoma.ActaOphthalmol86：716-726,20084）相良健：オキュラーサーフェスへの影響：防腐剤の功罪．あたらしい眼科25：789-794,20085）NakashimaM,NakamuraT,TeshimaMetal：Breakdownevaluationofcornealepithelialbarriercausedbyantiallergiceyedropsusinganelectrophysiologicmethod.JOculPharmTherap24：43-51,20086）NakamuraT,TeshimaM,KitaharaTetal：Sensitiveandreal-timemethodforevaluatingcornealbarrierconsideringtearflow.BiolPharmBull33：107-110,2010,7）SchoenwaldRD,HuangH-S：Cornealpenetrationbehaviorofbeta-blockingagentI：Physiochemicalfactors.Jあたらしい眼科Vol.29，No.4，2012539 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