———————————————————————-Page1（117）3990910-1810/09/\100/頁/JCLSあたらしい眼科26（3）：399403，2009cはじめに点眼薬の製剤設計においては，薬効だけでなく①角膜透過性および組織内移行性を含めた有効性，②角結膜および眼組織に対する安全性，③薬物の配合変化などの安定性，④さし心地（点眼時の眼刺激性）の4つの条件が要求される．これらの条件を満たすために，通常，点眼薬には主成分となる主剤のほかに，等張化剤，緩衝剤，防腐剤，可溶化剤，安定化剤，懸濁化剤，粘稠化剤などが含まれている1）．これらの成〔別刷請求先〕福田正道：〒920-0293石川県河北郡内灘町大学1-1金沢医科大学感覚機能病態学（眼科学）Reprintrequests：MasamichiFukuda,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,Daigaku1-1,Uchinada-machi,Kahoku-gun,Ishikawa920-0293,JAPANニューキノロン系抗菌点眼薬と非ステロイド抗炎症点眼薬の培養家兎由来角膜細胞に対する影響福田正道佐々木洋金沢医科大学感覚機能病態学（眼科学）CytotoxicEfectsofNewQuinoloneAntibioticOphthalmicSolutionsandNonsteroidalAnti-InlammatoryOphthalmicSolutionsonCulturedRabbitCornealCellLineMasamichiFukudaandHiroshiSasakiDepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity目的：4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬，および2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬の培養家兎由来角膜細胞（SIRC）に対する影響を比較検討した．方法：SIRC（2×105cells）を培養5日後に4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬〔0.5％LVFX（レボフロキサシン），0.3％GFLX（ガチフロキサシン），0.3％TFLX（トスフロキサシン），0.5％MFLX（モキシフロキサシン）〕および2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬（ジクロフェナクナトリウム点眼液0.1％，ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液0.1％）1mlを060分間接触させ，生存細胞数をCoulterカウンターで計測し50％細胞致死時間〔CDT50（分）〕を算出した．結果：4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬のCDT50はいずれも60分以上と長く，細胞障害への影響は少なかった．2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬のCDT50はジクロフェナクナトリウム点眼液では1.16分，ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液では2.56分と，いずれも高度の細胞障害が認められ，両薬剤間で有意差を認めた（p＜0.001，Studentt-検定）．結論：4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬の細胞障害への影響は少なかったのに対し，2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬は細胞障害性が強いことが示唆された．Weinvestigatedtheeectsof4newquinoloneantibioticophthalmicsolutions〔（0.5％LVFX（levooxacin）,0.3％GFLX（gatioxacin）,0.3％TFLX（tosuoxacin）,and0.5％MFLX（moxioxacin）〕and2nonsteroidalanti-inammatoryophthalmicsolutions（0.1％diclofenacsodiumophthalmicsolutionand0.1％bromfenacsodiumhydrateophthalmicsolution）onaculturedrabbitcornealcellline（SIRC）.CulturedSIRC（2×105cells）incubatedfor5dayswereexposedtothe6solutionsfor060min.SurvivingcellswerecountedbyaCoultercounter,and50％celldeathtime（CDT50；min）wascalculated.Cytotoxiceectsofthe4newquinoloneophthalmicsolutionswerealllowgrade（CDT50；＞60min）.Cytotoxiceectsof0.1％diclofenacsodiumophthalmicsolution（CDT50；1.16min）and0.1％bromfenacsodiumhydrateophthalmicsolution（CDT50；2.56min）werehighgrade；asignicantdierencewasnoted（p＜0.001,Student’st-test）.Theseresultssuggestthatthecytotoxiceectsofthe4newquinoloneophthalmicsolutionsarelessthanthoseofthe2nonsteroidalophthalmicsolutionstested.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）26（3）：399403,2009〕Keywords：ニューキノロン系抗菌点眼薬，非ステロイド性抗炎症点眼薬，培養家兎由来角膜細胞（SIRC），防腐剤，ベンザルコニウム塩化物．newquinoloneantibioticophthalmicsolutions,nonsteroidalanti-inammatoryophthalmicsolutions,culturedrabbitcornealcellline（SIRC）,preservative,benzalkoniumchloride.———————————————————————-Page2400あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009（118）分はいずれもアレルギー反応などによって角結膜に障害をひき起こす可能性があるが，なかでも防腐剤は難治性の障害を起こしうることから特に注意が必要である2,3）．現在，細菌性外眼部感染症や眼科周術期においては，幅広い抗菌スペクトルを有するニューキノロン系抗菌点眼薬や抗炎症作用を有する非ステロイド性抗炎症点眼薬などが汎用されているが，一定期間，反復点眼する必要があることを考えると安全性の確保も大きな関心事の一つである．本研究では4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬，および2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬の培養家兎由来角膜細胞（SIRC）に対する影響を比較検討した．I実験材料および方法〔実験材料〕検討した点眼液は，レボフロキサシン水和物（LVFX）点眼液0.5％（クラビットR点眼液0.5％：参天製薬），トスフロキサシントシル酸水和物（TFLX）点眼液0.3％（トスフロR点眼液0.3％：ニデック，オゼックスR点眼液0.3％：大塚製薬），ガチフロキサシン水和物（GFLX）0.3％点眼液（ガチフロR0.3％点眼液：千寿製薬），モキシフロキサシン塩酸塩（MFLX）点眼液0.5％（ベガモックスR点眼液0.5％：アルコン），以上4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬，およびジクロフェナクナトリウム点眼液0.1％（ジクロードR点眼液0.1％：わかもと製薬），ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液0.1％（ブロナックR点眼液0.1％：千寿製薬），以上2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬である．なお，TFLX点眼液0.3％は，2製品のうちトスフロR点眼液0.3％を使用した．各点眼薬の添加物については表1，2に示した．細胞は，DME（Dulbeccomodiedeagle）-10％FBS（fatalbovineserum）培地で37℃，5％CO2下で培養した家兎由来角膜細胞（ATCCCCL60SIRC）を使用した．〔実験方法〕1.各種点眼薬のSIRCに対する影響SIRC（2×105cells）を35×10mm細胞培養ディッシュ（FALCONR）のDME-10％FBS培地で5日間培養後，コンフルエントになった状態で，前記4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬および2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬を各々1ml，0，2，4，8，15，30，60分間接触させた後，シャ表1ニューキノロン系抗菌点眼薬の有効成分と添加物クラビットR点眼液0.5％トスフロR点眼液0.3％＊オゼックスR点眼液0.3％ガチフロR0.3％点眼液ベガモックスR0.5％点眼液有効成分（1ml中）レボフロキサシン水和物（LVFX）トスフロキサシントシル酸水和物（TFLX）ガチフロキサシン水和物（GFLX）モキシフロキサシン塩酸塩（MFLX）5mgトスフロキサシンとして2.04mgガチフロキサシンとして3mgモキシフロキサシンとして5mg添加物塩化ナトリウム硫酸アルミニウムカリウム塩化ナトリウムホウ酸pH調整剤ホウ砂塩酸等張化剤塩化ナトリウム水酸化ナトリウムpH調整剤2成分pH調整剤pH6.26.84.95.55.66.36.37.3浸透圧1.01.10.91.1（生理食塩水に対する比）0.91.1（0.9w/v％塩化Na液に対する比）0.91.1（0.9塩化Na液に対する比）＊トシル酸トスフロキサシン（TFLX）は，2製品のうちトスフロR点眼液0.3％を使用した．表2非ステロイド性抗炎症点眼薬の有効成分と添加物ジクロードR点眼液（0.1％）ブロナックR点眼液（0.1％）有効成分ジクロフェナクナトリウム1mg/mlブロムフェナクナトリウム水和物1mg/ml添加物ホウ酸ホウ砂クロロブタノールポビドンポリソルベート80ホウ酸，ホウ砂，乾燥亜硫酸ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物，ポビドンポリソルベート80ベンザルコニウム塩化物水酸化ナトリウムpH6.07.58.08.6浸透圧約1.0———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009401（119）ーレに残存した細胞数をCoulterカウンターで計測し50％細胞致死時間〔CDT50（分）〕を算出した．CDT50は，得られた生存率を基にして，時間-細胞死の曲線が二次関数になると仮定し，最小近似法で二次関数を決定後，細胞死が50％になる時間を算出した．二次方程式の解の公式，ax2＋bx＋c＝0（≠0），x＝b±－4ac/2aを用いた．CDT50を基準に，①5分以内（高度障害），②530分（中度障害），③30分以上（低度障害）に分類した．2.塩化ベンザルコニウムのSIRCに及ぼす影響SIRC（2×105cells）をDME-10％FBS培地で5日間培養後，生理食塩水と各濃度のベンザルコニウム塩化物溶液（0.01％，0.002％，0.005％）を各々1ml，0，2，4，8，15，30分間接触させた後，シャーレに残存した細胞数をCoulterカウンターで計測しCDT50を算出した．II結果1.各種点眼薬のSIRCに対する影響（図1，2）4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬のCDT50はいずれも60分以上で，細胞障害の程度は低く，角膜障害への影響は少ないと考えられた．2種類の非ステロイド性抗炎症点眼薬は接触時間の経過とともに細胞生存率が徐々に減少し，CDT50はジクロフェナクナトリウム点眼液では1.16分，ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液では2.56分と，いずれも高度の細胞障害が認められた．また，その影響はジクロフェナクナトリウム点眼液0.1％で有意に大きかった（p＜0.001，Studentt-検定）．2.ベンザルコニウム塩化物のSIRCに及ぼす影響（図3）生理食塩液，0.002％および0.005％ベンザルコニウム塩化物溶液のCDT50はいずれも30分以上と長く，細胞障害への影響は少なかったが，0.01％溶液では8.1分であり中度の障害がみられた．III考按筆者らはこれまでにSIRCを用いて種々の点眼薬の角膜細胞への影響を評価している．このSIRCは米国の細胞バンクにある家兎の角膜由来の樹立細胞で，世界的にさまざまな分野の研究に用いられている．眼の角膜障害試験においても広く使用されており，筆者らはSIRCを用いた角膜障害の評価法を独自に開発し，これまでに数多くの薬物の評価を行っている1,9）．また，未公開の成績であるが，予備実験において筆者らはSIRCで得た抗菌点眼薬の細胞障害の成績とヒト由来角膜上皮細胞株（HCE-T）を用いた成績では大きな差がないことを確認したうえで，SIRCを実験に用いている．今回は，有効成分が抗菌作用を示し添加物に防腐剤が含まれていないニューキノロン系抗菌点眼薬に着眼し，防腐剤を含む非ステロイド性抗炎症点眼薬との角膜細胞への影響の相理時間（分）生存率（％）20406080100012340＊：p＜0.001Student’st-testn＝5～6＊＊＊＊＊＊＊：ブロムフェナクナトリウム2.56：ジクロフェナクナトリウム水和物1.16CDT50（分）図2非ステロイド系抗菌点眼薬のSIRCへの影響分＝5～6CDT50（分）020406080100051525301020：ベンザルコニウム塩化物0％（生食）＞30：ベンザルコニウム塩化物0.002％＞30：ベンザルコニウム塩化物0.005％＞30：ベンザルコニウム塩化物0.01％8.1図3ベンザルコニウム塩化物溶液のSIRCへの影響0分1分4分8分15分30分60分TFLX100.097.691.596.194.496.895.9GFLX100.092.587.392.295.189.975.8LVFX100.096.698.193.491.179.661.4MFLX100.086.289.680.076.567.552.8図1ニューキノロン抗菌点眼薬のSIRCへの影響＝4～6生存率（％）処理時間（分）———————————————————————-Page4402あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009（120）違を検討した．眼科医療に携わる者にとって，点眼薬の安全性を知ることは，臨床において大変重要な事項である．点眼薬による角膜上皮障害は主剤あるいは添加物による細胞毒性が直接かかわると考えられる3）．添加物の一つである防腐剤には，ベンザルコニウム塩化物，クロロブタノール，パラオキシ安息香酸エステル類などが使用されているが，これらは難治性の角膜上皮障害をひき起こす可能性が報告されている3）．認可市販されている点眼薬のうち，60％にベンザルコニウム塩化物が使用されているといわれており4），その濃度は0.0010.01％である5,6）．高橋ら7）は，ヒト結膜上皮細胞を用いた細胞毒性試験においてベンザルコニウム塩化物は低濃度でも細胞に障害を認めるため，通常濃度としては0.00250.005％が妥当であるとしながらも，たとえ0.0025％でも頻回点眼により粘膜障害を生じる可能性があることを報告している．点眼薬の角膜細胞障害性の客観的評価方法についてこれまであまり検討されてこなかったが，筆者らはCDT50（分）を指標とする評価方法を考案し，活用している．今回もSIRCを5日間培養した後，各点眼薬を一定時間接触させてシャーレに残存した細胞数をCoulterカウンターで計測して生存率（％）を算出し，培養細胞に接触してから細胞生存率が50％にまで減少した時点の時間で評価した．今回の検討では，薬剤接触後60分間測定を行ったが，4種類のニューキノロン系抗菌点眼薬のCDT50はいずれも60分以上であり，細胞障害は低度であることが確認された．また，臨床的には05分までの点眼早期におけるCDT50が重要な意味をもつと考えているが，今回の成績では，いずれの点眼薬の早期の生存率も高く，角膜障害性が低いことが予想された．細胞障害性が低かった原因として，主剤そのものの細胞障害性が低いことに加え，防腐剤が含まれておらず，添加物の数も少なかったことが推察される．なお，点眼薬の接触時間とともにMFLX点眼液，LVFX点眼液，GFLX点眼液，TFLX点眼液の順で細胞生存率の減少がみられた．4薬剤間の有意差は検討していないが，TFLX点眼液における生存率減少カーブは緩やかであり，細胞障害への影響が最も少ない結果であった．この結果は，薬液添加後72時間培養後の細胞増殖に対する影響をみた櫻井ら8）の報告と異なるものとなったが，これは櫻井らが主剤の原末を溶解して使用したのに対して，本研究では臨床での影響を直接評価するために点眼液をそのまま用いたことなどが理由にあげられる．今回，家兎由来SIRC細胞で角膜障害性を評価したが，その一方で，多くの研究者によって角膜実質細胞に対しても評価が行われ，角膜上皮細胞との相違点が明らかにされている811）．一方，非ステロイド性抗炎症点眼薬においては，防腐剤のベンザルコニウム塩化物が点眼による副作用として角膜上皮障害を起こすことが報告されている12）．ジクロフェナクナトリウム点眼液においては，主剤とクロロブタノールとの相互作用により細胞障害が増加している可能性が高いことを，筆者らは確認している13）．また，主剤である非ステロイド性抗炎症薬が角膜上皮障害を起こしうることも示唆されており，その原因としてシクロオキシゲナーゼ阻害によりリポキシゲナーゼが活性化され，生成されたさまざまなケミカルメディエーターにより炎症細胞の浸潤が起こる，細胞増殖抑制作用による，角膜知覚低下によるなどさまざまな説が提唱されている14）．今回の検討において，ジクロフェナクナトリウム点眼液のCDT50は1.16分，ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液では2.56分であり，両薬剤ともに高度の細胞障害がみられた．ジクロフェナクナトリウム点眼液には防腐剤としてクロロブタノールが，ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液にはベンザルコニウム塩化物が含まれており，角膜障害には主剤そのものの影響に加え，これら防腐剤の影響があったものと推察される．ブロムフェナクナトリウム水和物点眼液では，主剤以外に種々の添加物を含み，特にベンザルコニウム塩化物を含んでいることが障害の大きな原因ではないかと考えている．ベンザルコニウム塩化物を含まないジクロフェナクナトリウム点眼液において細胞障害が有意に強かったが，これは白内障術後の角膜上皮障害について検討した進藤ら11）の報告とも一致する．防腐剤を含めた添加物の濃度は各点眼薬により異なり，その種類も多いことから，ベンザルコニウム塩化物以外の添加物またはその濃度が複雑に角膜上皮に影響を及ぼしている可能性がある．したがって，主剤はもちろん防腐剤を含めた添加物の種類およびその濃度による影響については今後の検討課題である．いずれにしろ，今回検討したニューキノロン系抗菌点眼薬はいずれも角膜細胞への影響が少ないことがCDT50を用いた評価で確認された．客観的評価に基づく今回の結果は，細菌性外眼部感染症および眼科周術期におけるニューキノロン系抗菌点眼薬の有用性を細胞障害性，すなわち安全性の側面から裏付ける有意義な知見といえよう．文献1）福田正道，村野秀和，山本佳代ほか：クロモグリク酸ナトリウム点眼液の角膜細胞への影響．あたらしい眼科22：1675-1678,20052）小玉裕司：コンタクトレンズと点眼薬．日コレ誌49：268-271,20073）植田喜一，柳井亮二：シリコーンハイドロゲルコンタクトレンズとマルチパーパスソリューション，点眼薬．あたらしい眼科25：923-930,20084）中村雅胤，山下哲司，西田輝夫ほか：塩化ベンザルコニウムの家兎角膜上皮に対する影響．日コレ誌35：238-241,19935）高橋信夫，佐々木一之：防腐剤とその眼に与える影響．眼科31：43-48,1989———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.26，No.3，2009403（121）6）島潤：点眼剤の防腐剤とその副作用．眼科33：533-538,19917）高橋信夫，向井佳子：点眼用防腐剤塩化ベンザルコニウムの細胞毒性とその作用機序─細胞培養学的検討─．日本の眼科58：945-950,19878）櫻井美晴，羽藤晋，望月弘嗣ほか：フルオロキノロン剤が角膜上皮細胞および実質細胞に与える影響．あたらしい眼科23：1209-1212,20069）SeitzB,HayashiS,WeeWRetal：Invitroeectofami-noglycosidesanduoroquinolonesonkeratocytes.InvestOphthalmolVisSci37：656-665,199610）LeonardiA,PapaV,FregonaIetal：Invitroeectsofuoroquinoloneandaminoglycosideantibioticsonhumankeratocytes.Cornea25：85-90,200611）CutarelliPE,LassJH,LazarusHMetal：Topicaluoro-quinolones：antimicrobialactivituabdinvitrocornealepi-thelialtoxicity.CurrEyeRes1：557-563,199112）新城百代，仲村佳巳，酒井寛ほか：防腐剤を含まないb遮断薬による角膜上皮障害の改善．臨眼97：539-542,200313）福田正道，山代陽子，萩原健太ほか：ジクロフェナクナトリウム点眼薬の培養家兎角膜細胞に対する障害性．あたらしい眼科22：371-374,200514）進藤さやか，飯野倫子，大下雅世ほか：白内障術後の非ステロイド抗炎症薬による角膜上皮障害．眼紀56：247-250,2005＊＊＊