《原著》あたらしい眼科31（11）：1687.1691，2014c高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞におけるレバミピドの抗炎症作用中嶋英雄田中直美浦島博樹篠原久司大塚製薬株式会社赤穂研究所Anti-inflammatoryEffectsofRebamipideinHyperosmolar-stressedHumanCornealEpithelialCellsHideoNakashima,NaomiTanaka,HirokiUrashimaandHisashiShinoharaAkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.培養ヒト角膜上皮細胞において高浸透圧ストレスによって誘導される炎症性サイトカインの産生ならびにmitogen-activatedproteinkinase（MAPキナーゼ）経路の活性化に対するレバミピドの効果について検討した．細胞をサブコンフルエントまで培養した後，培地から増殖添加剤を除去して以下の検討に用いた．塩化ナトリウムにて調製した400.500mOsMの高浸透圧培地で24時間細胞を培養し，培養上清中の炎症性サイトカイン量をイムノビーズアッセイで測定した．つぎに，1mMまたは2mMレバミピド含有培地で細胞を1時間前処理した後，各濃度のレバミピド存在下で500mOsM培地にて24時間培養した．培養上清中の炎症性サイトカイン量に加えて，炎症性サイトカイン遺伝子の発現量およびMAPキナーゼタンパクのリン酸化レベルをそれぞれリアルタイムRT-PCRおよびイムノビーズアッセイにて評価した．培養上清中のtumornecrosisfactoralpha，monocytechemotacticprotein-1およびinterleukin-7は浸透圧の上昇に依存して増加した．レバミピドはこれらの炎症性サイトカインの産生をタンパクおよび遺伝子レベルで抑制するとともに，高浸透圧ストレスにより亢進されたc-JunN-terminalkinaseおよびp38MAPKのリン酸化を抑制した．レバミピドは，ヒト角膜上皮細胞においてMAPキナーゼ経路の活性化を抑制することにより，高浸透圧ストレス誘導性の炎症性サイトカイン産生を抑制すると考えられた．Thisstudyexaminedtheeffectofrebamipideoninflammatorycytokineproductioninhyperosmolar-stressedhumancornealepithelialcells,andthemechanismbywhichmitogen-activatedprotein（MAP）kinasepathwaysmediatetheactionofrebamipide.Subconfluentcellswereswitchedtogrowthsupplement-freemediumbeforetreatment.Cellswereculturedfor24hoursinthemedium,theosmolarityofwhichwasincreased（400-500mOsM）byaddingNaCl；inflammatorycytokinesreleasedinthemediumwerethenmeasuredusingimmunobeadassay.Next,cellswereculturedfor24hoursin500mOsMmediumwith1mMor2mMrebamipide,whichwaspre-added1hourbeforebeingreplacedwith500mOsMmedium.Then,inadditiontoassessmentofinflammatorycytokinesinthemedium,inflammatorycytokinegeneexpressionandMAPkinasephosphorylationlevelwereassessedusingreal-timeRT-PCRandimmunobeadassay.Tumornecrosisfactoralpha,monocytechemotacticprotein-1andinterleukin-7proteininthemediumincreasedinanosmolarity-dependentmanner.RebamipidesuppressedtheproductionoftheseinflammatorycytokinesatboththeproteinandmRNAlevels,andsuppressedthephosphorylationlevelsofc-JunN-terminalkinaseandp38MAPK,whichwereenhancedbyhyperosmolarity.Theseresultssuggestthatrebamipidesuppresseshyperosmolarity-inducedinflammatorycytokineproductioninhumancornealepithelialcellsviaMAPkinasepathways.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（11）：1687.1691,2014〕Keywords：ヒト角膜上皮細胞，高浸透圧ストレス，炎症性サイトカイン，MAPキナーゼ経路，レバミピド．humancornealepithelialcells,hyperosmolarstress,inflammatorycytokines,MAPkinasepathway,rebamipide.〔別刷請求先〕中嶋英雄：〒678-0207兵庫県赤穂市西浜北町1122-73大塚製薬株式会社赤穂研究所Reprintrequests：HideoNakashima,AkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.,1122-73Nishihamakita-cho,Akoshi,Hyogo678-0207,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（121）1687 はじめにドライアイはさまざまな要因に起因する涙液および眼表面上皮における慢性疾患である．その発症メカニズムについては，国内では，涙液と角結膜上皮の異常による涙液安定性の低下がコアメカニズムとして存在し，炎症はこれらが悪循環を起こした結果であると考えられている1）のに対して，海外では，涙液の分泌減少/蒸発亢進による浸透圧の上昇ならびにそれに伴う眼表面の炎症がメカニズムの中心にあり，炎症により上皮細胞ならびに腺組織が障害された結果，涙液層の不安定化が引き起こされるという考え方が主流となっている2）．ドライアイ治療用点眼剤であるレバミピド点眼液は，眼表面ムチンの増加作用3,4）により涙液を安定化させることで角結膜上皮障害を改善する5）．胃炎・胃潰瘍治療剤でもあるレバミピドは胃粘膜組織において抗炎症作用を示すことが知られてきたが，近年，角膜および結膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生を抑制することが報告されている6,7）．本検討では，高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞を用いてレバミピドの抗炎症作用について検討した．I実験方法1.ヒト角膜上皮細胞の培養初代ヒト角膜上皮細胞（HCEC：LifeTechnologies）は増殖添加剤（HumanCornealGrowthSupplement：LifeTechnologies）および抗菌/抗真菌剤（Gentamicin/AmphotericinB：LifeTechnologies）を加えた基礎培地（Epilife：LifeTechnologies，305mOsM）にて培養した．コラーゲンTypeIコート100mmディッシュ（IWAKI）に細胞を播種し，CO2インキュベーター（37℃，5％CO2）内でサブコンフルエントまで培養した後，0.025％トリプシン/EDTA（エチレンジアミン四酢酸）で細胞を.離した．コラーゲンTypeIコート24ウェルプレート（IWAKI）に5×104/ウェルで細胞を播種し，サブコンフルエントまで培養した後に増殖添加剤を除去して以下の検討に用いた．2.高浸透圧ストレスの負荷とレバミピドの添加高浸透圧ストレスがヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響に関する検討では，増殖添加剤を除去した基礎培地で24時間培養後に高浸透圧培地（400，450または500mOsM；基礎培地に塩化ナトリウムを加えて調製）に交換し，さらに24時間培養した．レバミピドの効果に関する検討では，増殖添加剤を除去した基礎培地で23時間培養後に1mMまたは2mMレバミピドを添加した基礎培地に交換し，その1時間後に同濃度のレバミピドを添加した500mOsM培地に交換した後，さらに24時間培養した．3.培養上清中の炎症性サイトカインタンパクの定量Bio-Plexアッセイシステム（Bio-Rad）を用いたイムノビ1688あたらしい眼科Vol.31，No.11，2014ーズアッセイ法により培養上清中の炎症性サイトカインタンパク量を評価した．測定サンプルの調製はアッセイキット（ヒトサイトカイン17-Plexパネル）推奨のプロトコールに従って実施し，Bio-Plex200システムを用いて測定した．4.炎症性サイトカイン遺伝子の発現解析PureLinkRNAMiniKit（LifeTechnologies）でtotalRNAを抽出し，PrimeScriptRTreagentKit（タカラバイオ）でcDNAを合成した．SsoFastProbesSupermix（BioRad）およびTaqmanGeneExpressionAssays（tumornecrosisfactoralpha：TNF-a［Hs01113624_g1］，monocytechemotacticprotein-1：MCP-1［Hs00234140_m1］interleukin-7：IL-7［Hs00174202_m1］，glyceraldehyde(，)3-phosphatedehydrogenase：GAPDH［Hs02758991_g1］：AppliedBiosystems）を用いてPCR（polymerasechainreaction）反応液を調製し，CFX96リアルタイムPCR解析システム（Bio-Rad）にて［95℃30秒→（95℃5秒→60℃10秒）×39サイクル］の反応条件で各遺伝子の発現量を解析した．GAPDH遺伝子を内部標準として比較Ct法により各遺伝子の相対発現比を算出した．5.MAPキナーゼ経路活性化の評価種々の環境ストレスによって活性化されるmitogen-activatedproteinkinase（MAPキナーゼ）経路について，BioPlexアッセイシステムを用いたイムノビーズアッセイ法によりc-JunN-terminalkinase（JNK）およびp38MAPKのリン酸化レベルを指標に評価した．測定サンプルは，細胞から抽出した総タンパクをリン酸化型またはトータルターゲットのJNKあるいはp38MAPKに特異的な抗体ビーズ，ついでビオチン化検出抗体と反応させた後，CellSignalingReagentKitを用いて調製した．Bio-Plex200システムにて各サンプル中のリン酸化型MAPキナーゼタンパク量，ならびにリン酸化型を含むトータルのターゲットMAPキナーゼタンパク量を測定した．トータルターゲットタンパク量でリン酸化型タンパク量を補正してリン酸化レベルを算出した．6.統計解析結果は平均値±標準誤差で示した．SAS（SASInstituteJapan，ver.9.3）を用いて5％を有意水準として解析した．高浸透圧ストレスが炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響については，直線回帰分析を行ったが単調増加性を確認できなかったため，基礎培地群に対してDunnett検定（両側）を実施した．レバミピドの効果に関する検討においては，基礎培地群と500mOsM培地（レバミピド非添加）群の比較は対応のないt検定を実施した．500mOsM培地の3群間（レバミピド非添加，1mMレバミピド添加および2mMレバミピド添加）の比較は直線回帰分析にて単調減少性を確認した後，レバミピド非添加群に対するWilliams検定（下側）を実施した．なお，単調減少性が確認できなかった場合は非添加群に（122） 対するDunnett検定（両側）を実施した．II結果1.高浸透圧ストレスによるヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生誘導（図1）培養上清中のTNF-a，MCP-1およびIL-7は浸透圧の上昇に依存して増加し，TNF-aおよびIL-7が500mOsM培地群で，MCP-1が450mOsMおよび500mOsM培地群で有意に高値であった（p＜0.01）．2.炎症性サイトカインタンパクの産生増加に対するレバミピドの抑制効果（図2）500mOsM（レバミピド非添加）培地群のTNF-a，MCP-1およびIL-7はいずれも基礎培地群と比較して有意に高値であった（p＜0.01）．また，1mMおよび2mMレバミピド添加群では非添加群と比較していずれのサイトカインも有意に低値を示した（TNF-aおよびIL-7：p＜0.01，MCP-1：p＜0.01）．3.炎症性サイトカイン遺伝子の発現増強に対するレバミピドの抑制効果（図3）500mOsM（レバミピド非添加）培地群のTNF-a，MCP-1およびIL-7遺伝子の発現量はいずれも基礎培地群と比較して有意に高値であった（p＜0.01）．一方，1mMおa$$bよび2mMレバミピド添加群の遺伝子発現量は非添加群と比較していずれのサイトカインも有意に低値を示した（p＜0.01）．4.MAPキナーゼ経路の活性化に対するレバミピドの抑制作用（図4）500mOsM（レバミピド非添加）培地群ではMAPキナーゼタンパクであるJNKおよびp38MAPKのリン酸化レベルが有意に亢進していた（JNK：p＜0.05，p38MAPK：p＜0.01）．これに対して，1mMおよび2mMレバミピド添加群では非添加群と比較してリン酸化レベルの亢進は抑制される傾向を示し，JNKでは2mMレバミピド添加群にて，また，p38MAPKでは1mMおよび2mMレバミピド添加群にて有意であった（p＜0.05）．III考按ドライアイはさまざまな要因に起因する涙液および眼表面上皮における慢性疾患であるが，国内と海外を比較した場合，そのコアメカニズムの考え方の違いにより，治療に対するアプローチは大きく異なる．国内では，涙液安定性の低下がドライアイのコアメカニズムであるという考え方のもと，涙液安定性に関与する各因子をターゲットにした複数のドライアイ治療薬が開発され，これらを用いた治療（tearfilmc$$$$18015030$$251501201202090159060106030305000図1高浸透圧ストレスによるヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生誘導pg/mLa：TNF-a，b：MCP-1，c：IL-7．各値は6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，400mOsM，450mOsM，500mOsM．＄＄p＜0.01；Dunnett検定（両側）．a##＊＊b##$$c##＊＊4060501520＊＊3062010310000＊＊図2炎症性サイトカインタンパクの産生増加に対するレバミピドの抑制効果40$$91230pg/mLa：TNF-a，b：MCP-1，c：IL-7．各値は4.6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，500mOsM（レバミピド非添加），500mOsM＋1mMレバミピド，500mOsM＋2mMレバミピド．##p＜0.01；対応のないt検定．＊＊p＜0.01；Williams検定（下側）：直線回帰分析にて単調減少性を確認した後に実施した．＄＄p＜0.01；Dunnett検定（両側）．（123）あたらしい眼科Vol.31，No.11，20141689 Relativeexpressionratioa##＊＊b##＊＊c##＊＊4104＊＊83＊＊36224112000＊＊図3炎症性サイトカイン遺伝子の発現増強に対するレバミピドの抑制効果a：TNF-a，b：MCP-1，c：IL-7．各値は305mOsM群の平均値を1としたときの相対発現比で，グラフは6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，500mOsM（レバミピド非添加），500mOsM＋1mMレバミピド，500mOsM＋2mMレバミピド．##p＜0.01；対応のないt検定．＊＊p＜0.01；Williams検定（下側）：直線回帰分析にて単調減少性を確認した後に実施した．abれ，角膜組織においてリンパ管形成を誘導する作用が報告さ3#＊3##＊れている12）．以上のことから，本モデルは涙液浸透圧の上昇Phosphorylated/Totalを模したinvitro炎症モデルとして有用であると考えられ22＊た．つぎに，本モデルにおけるTNF-a，MCP-1およびIL-7の産生ならびにMAPキナーゼ経路の活性化に対する11レバミピドの効果を検討した．レバミピドはTNF-a，MCP-1およびIL-7の産生をタンパクおよび遺伝子レベル図4MAPキナーゼ経路の活性化に対するレバミピドの抑制で抑制したのに加え，JNKおよびp38MAPKタンパクのリ00作用a：JNK，b：p38MAPK．各値は305mOsM群の平均値を1としたときの相対値で，グラフは6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，500mOsM（レバミピド非添加），500mOsM＋1mMレバミピド，500mOsM＋2mMレバミピド．#p＜0.05，##p＜0.01；対応のないt検定．＊p＜0.05；Williams検定（下側）：直線回帰分析にて単調減少性を確認した後に実施した．orientedtherapy）が始まっている1）．これに対して海外では，涙液浸透圧の上昇に伴う炎症こそがドライアイの本質であるとする考えから抗炎症を切り口とした治療が行われており，免疫抑制剤であるシクロスポリン点眼による治療効果が報告されている8）．レバミピド点眼液は眼表面のムチンをターゲットとして開発されたドライアイ治療薬であるが，最近，角膜および結膜上皮細胞において各種刺激による炎症性サイトカイン誘導に対する抑制効果6,7）やアレルギー性結膜炎患者の炎症症状に対する有効性9）が報告されている．そこで今回，高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞を用いてレバミピドの抗炎症作用について検討した．まず，培養液の浸透圧がヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響について検討したところ，高浸透圧培地群ではTNF-a，MCP-1およびIL-7の産生が亢進した．TNF-aおよびMCP-1はドライアイ患者の涙液中で増加することが報告されており10,11），また，IL-7はT細胞の成熟やホメオスタシスに関与するサイトカインとして知ら1690あたらしい眼科Vol.31，No.11，2014ン酸化を抑制した．レバミピドは，角膜上皮細胞に対する高浸透圧ストレスによって誘導されるMAPキナーゼ経路の活性化を抑制することにより炎症性サイトカインの産生亢進を抑制したと推察された．現在用いられている涙液浸透圧の測定方法はメニスカス涙液の浸透圧を測定するものである．これまでの報告では，ドライアイ患者における涙液浸透圧の上昇が指摘されている13）一方で，健常人と比較して浸透圧に差はないとする報告14）もあり，涙液浸透圧のドライアイへの関与に対しては賛否両論がある．現時点では角膜表面涙液の浸透圧を直接測定した報告はないものの，高浸透圧の点眼液が眼不快症状および涙液安定性に及ぼす影響を検討したLiuらの報告15）によると，高浸透圧の涙液が眼表面に障害を与える可能性が示唆されている．さらにLiuらは，塩化ナトリウムによる浸透圧の上昇が眼不快症状に影響するのは500mOsM以上であるとしており，この数値は今回の検討でヒト角膜上皮細胞から炎症性サイトカインの誘導が確認された浸透圧と一致する．また，眼表面の炎症性サイトカイン量は自覚症状の重症度と相関するという報告16）もあり，レバミピド点眼液による自覚症状改善効果5）にはレバミピドの有する抗炎症作用が寄与していることが推測された．これらのことから，レバミピド点眼液は，涙液浸透圧の上昇に伴う炎症に起因すると疑われるドライアイに対しても治療の選択肢の一つになりうると考えられた．今回の検討から，レバミピド点眼液は眼表面においてムチ（124） ン産生促進剤としてだけではなく抗炎症作用を有する薬剤としての可能性も示唆されたことから，多因性の眼疾患であるドライアイに対して有用な治療剤であると思われた．文献1）横井則彦，坪田一男：ドライアイのコア・メカニズム─涙液安定性仮説の考え方─．あたらしい眼科29：291-297,20122）Thedefinitionandclassificationofdryeyedisease：reportoftheDefinitionandClassificationSubcommitteeoftheInternationalDryEyeWorkshop（2007）.OculSurf5：75-92,20073）RiosJD,ShatosMA,UrashimaHetal：EffectofOPC12759onEGFreceptoractivation,p44/p42MAPKactivity,andsecretioninconjunctivalgobletcells.ExpEyeRes86：629-636,20084）ItohS,ItohK,ShinoharaH：Regulationofhumancornealepithelialmucinsbyrebamipide.CurrEyeRes39：133141,20145）KinoshitaS,OshidenK,AwamuraSetal：Arandomized,multicenterPhase3studycomparing2％Rebamipide（OPC-12759）with0.1％sodiumhyaluronateinthetreatmentofdryeye.Ophthalmology120：1158-1165,20136）TanakaH,FukudaK,IshidaWetal：RebamipideincreasesbarrierfunctionandattenuatesTNFa-inducedbarrierdisruptionandcytokineexpressioninhumancornealepithelialcells.BrJOphthalmol97：912-916,20137）UetaM,SotozonoC,YokoiNetal：RebamipidesuppressesPolyI：C-stimulatedcytokineproductioninhumanconjunctivalepithelialcells.JOculPharmacolTher29：688-693,20138）SchultzC：Safetyandefficacyofcyclosporineinthetreatmentofchronicdryeye.OphthalmolEyeDis24：37-42,20149）UetaM,SotozonoC,KogaAetal：UsefulnessofanewtherapyusingrebamipideeyedropsinpatientswithVKC/AKCrefractorytoconventionalanti-allergictreatments.AllergolInt63：75-81,201410）NaKS,MokJW,KimJYetal：Correlationsbetweentearcytokines,chemokines,andsolublereceptorsandclinicalseverityofdryeyedisease.InvestOphthalmolVisSci53：5443-5450,201211）BoehmN,RiechardtAI,WiegandM：Proinflammatorycytokineprofilingoftearsfromdryeyepatientsbymeansofantibodymicroarrays.InvestOphthalmolVisSci52：7725-7730,201112）IolyevaM,AebischerD,ProulxSTetal：Interleukin-7isproducedbyafferentlymphaticvesselsandsupportslymphaticdrainage.Blood122：2271-2281,201313）LempMA,BronAJ,BaudouinCetal：Tearosmolarityinthediagnosisandmanagementofdryeyedisease.AmJOphthalmol151：792-798,201114）MessmerEM1,BulgenM,KampikA：Hyperosmolarityofthetearfilmindryeyesyndrome.DevOphthalmol45：129-138,201015）LiuH：Alinkbetweentearinstabilityandhyperosmolarityindryeye.InvestOphthalmolVisSci50：3671-3679,200916）ZhangJ,YanX,LiH：Analysisofthecorrelationsofmucins,inflammatorymarkers,andclinicaltestsindryeye.Cornea32：928-932,2013＊＊＊（125）あたらしい眼科Vol.31，No.11，20141691