0910-1810/11/\100/頁/JCOPY（107）261《原著》あたらしい眼科28（2）：261.265，2011cはじめに眼表面における分泌型ムチンの一種であるMUC5ACは，結膜上皮組織内の杯細胞において生合成・貯蔵される高分子糖蛋白質であり，豊富なシステイン残基をもつ4つのドメインと大量の糖鎖と結合しているtandemrepeatドメインから成っている．大量の糖鎖は，ブラシ状にコア蛋白質に結合〔別刷請求先〕七條優子：〒630-0101生駒市高山町8916-16参天製薬株式会社研究開発センターReprintrequests：YukoTakaoka-Shichijo,Research&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.,8916-16Takayamacho,Ikoma,Nara630-0101,JAPANジクアホソルナトリウムのウサギ結膜組織からのMUC5AC分泌促進作用七條優子阪元明日香中村雅胤参天製薬株式会社研究開発センターEffectofDiquafosolTetrasodiumonMUC5ACSecretionbyRabbitConjunctivalTissuesYukoTakaoka-Shichijo,AsukaSakamotoandMasatsuguNakamuraResearch&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.結膜組織からの分泌型ムチン（MUC5AC）量に及ぼすP2Y2受容体作動薬であるジクアホソルナトリウムの影響を検討する目的で，MUC5ACに特異的なenzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）を確立し，ウサギ結膜組織から分泌されるMUC5AC量に及ぼすジクアホソルナトリウムの影響を検討した．また同時に，ヒアルロン酸ナトリウムのMUC5AC分泌に対する作用についても検討した．今回のELISA法に用いた抗MUC5AC抗体（Clone45M1抗体）は，過ヨウ素酸シッフ反応と同様に結膜杯細胞で陽性反応を示し，結膜組織に存在する250kDa以上の蛋白質と親和性の高いことが示された．また，本ELISA法において，結膜組織培養上清液中のMUC5AC量と反応最終検出値との相関性は高く（相関係数0.99），非特異的反応は認められなかった．さらに，ジクアホソルナトリウムは，ウサギ結膜組織からのMUC5ACの分泌を濃度依存的に促進したが，ヒアルロン酸ナトリウムは影響しなかった．以上の成績から，ウサギ結膜組織からのMUC5AC分泌量は，抗MUC5AC抗体を用いて定量的に測定できることが明らかとなった．また，ジクアホソルナトリウムは，結膜組織からのMUC5AC分泌促進作用を有するのに対し，ヒアルロン酸ナトリウムは本作用を示さなかった．ToinvestigatetheeffectoftheP2Y2receptoragonistdiquafosoltetrasodiumonthesecretorymucin（MUC5AC）secretionbyconjunctivaltissues,weestablishedtheenzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）forMUC5AC.WethenexaminedtheeffectofdiquafosoltetrasodiumonMUC5ACsecretionbyrabbitconjunctiva.Inaddition,westudiedwhetherhyaluronicacidinducedMUC5ACsecretion.Glycoproteininrabbitconjunctivalgobletcellsshowedpositivereactivityforstainingwithanti-MUC5ACantibody（Clone45M1antibody）,aswellasforPeriodicacid-Schiffstaining.ThemolecularweightoftheClone45M1antibody-bindingproteinsintheconjunctivaltissuewasgreaterthan250kDa.OntheELISAsystem,MUC5ACconcentrationwashighlycorrelatedwiththefinalreactionvalue（correlationfactor＝0.99）,andnon-specificreactionwasnotobserved.Theadditionofdiquafosoltetrasodiumtoculturedrabbitconjunctivaltissuesresultedinaconcentration-dependentincreaseinMUC5ACsecretion；theadditionof0.1％hyaluronicaciddidnot.Fromtheseresults,weestablishedamethodofusingELISAtoquantitativelymeasureMUC5ACsecretionbyrabbitconjunctivaltissues,usingtheClone45M1antibody.Furthermore,diquafosoltetrasodiumhadastimulatoryeffectonMUC5ACsecretionbyrabbitconjunctiva,buthyaluronicaciddidnot.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（2）：261.265,2011〕Keywords：ジクアホソルナトリウム，P2Y2受容体作動薬，MUC5AC分泌，ELISA，ウサギ結膜組織．diquafosoltetrasodium,P2Y2receptoragonist,MUC5ACsecretion，ELISA,rabbitconjunctivaltissues.262あたらしい眼科Vol.28，No.2，2011（108）し，ブラシ状部位の一つ一つがジスルフィド結合で重合しているため，MUC5ACは，非常に粘性の高い糖蛋白質であり，膜結合型ムチンと協働して眼表面の涙液保持などに対して重要な役割を担っている1）．ドライアイ症状を示すSjogren症候群2）や炎症が強いアレルギー性結膜炎3）のように炎症が慢性化している症例では，結膜上皮におけるMUC5ACの発現が低下しており，MUC5ACの蛋白質レベルでの減少が眼表面の涙液保持の低下，強いては涙液層破壊時間を短縮していると考えられている4）．また，ドライアイ患者に精製ムチン溶液を点眼することで，角結膜上皮障害が改善することも報告されている5）．したがって，ドライアイ症状の一つである眼表面の涙液保持の低下を改善するためには，眼表面にMUC5ACを補給する必要があると考えられる．ヒアルロン酸ナトリウムは，その薬理作用（角膜上皮伸展作用および保水作用）により，角結膜上皮障害改善薬として幅広く使用されてきた．しかし，ムチンの被覆度が低下している症状に対しての効果が弱いと考えられている6）．P2Y2受容体作動薬であるアデノシン三リン酸（ATP）あるいはウリジン三リン酸（UTP）は，ヒト結膜組織からのムチン分泌を促進することが報告されており7），UTPと同程度のP2Y2受容体作動作用を示すジクアホソルナトリウムも，正常ウサギ8）および正常ラット9）の結膜組織から糖蛋白質の分泌を促進することが報告されている．そこで，今回，ウサギ結膜組織から分泌されるMUC5ACを定量的に評価できる系（enzyme-linkedimmunosorbentassay：ELISA）を構築し，その系を用いてジクアホソルナトリウムの結膜組織からのMUC5AC分泌促進作用について，ヒアルロン酸ナトリウムと比較検討した．I実験方法1.被験溶液の調製法ジクアホソルナトリム（ジクアホソル，ヤマサ醤油）およびヒアルロン酸ナトリウム（キューピー）は，normalbicarbonatedRinger’ssolution（BR：111.5mMNaCl，4.8mMKCl，0.75mMNaH2PO4，29.2mMNaHCO3，1.04mMCaCl・2H2O，0.74mMMgCl2・6H2O，5.0mMD-glucose）にて溶解した．2.ウサギ結膜摘出雄性日本白色ウサギ（北山ラベス）にネンブタール注射液（大日本住友製薬）を1mL/kgになるよう静脈注射して全身麻酔し，腹部大動脈からの脱血により安楽殺した．ケイセイ替刃メスを用いて眼窩周囲に切り込みを入れ，眼窩との結合組織を.離させ，ハサミを用いて外眼筋および視神経を切断し，結膜およびその周辺組織部分を分離・摘出した．なお，本研究は，「動物実験倫理規程」，「動物実験における倫理の原則」，「動物の苦痛に関する基準」などの参天製薬株式会社社内規程を遵守し実施した．3.抗MUC5AC抗体（Clone45M1）の特異性a.組織学的検討摘出した結膜組織を10％中性ホルマリン（pH7.2.7.4）にて室温で浸漬固定した．パラフィン包埋を行った後，約3μmの連続切片を薄切した．過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色および抗MUC5AC抗体（Clone45M1：マウス抗ヒトMUC5AC抗体，NeoMarkers），ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG（免疫グロブリンG）抗体（DAKO）およびジアミノベンチジン（DAKO）を用いて高分子ポリマー法による免疫組織化学的染色を行った．免疫染色の特異性は，陰性対照抗体として抗マウスIgG抗体（DAKO）を反応させて確認した．b.ウェスタンブロット摘出した結膜組織に組織溶解液（10mMTris，1mMEDTA，1％蛋白分解酵素阻害剤）を加え，ホモジナイズし，遠心（5,000rpm，2分）操作により，上清（ウサギ結膜組織溶解液）を回収した．ウサギ結膜組織溶解液をlaemmlisamplebuffer（Bio-Rad）と混合し，95℃，5分間加熱処理した後，4.20％ポリアクリルアミドゲル（第一化学）にて電気泳動し，PVDF膜にブロッティングを行った．洗浄液（0.05％Tween20含有TBS），ブロッキング液（イムノブロックR：DSファーマバイオメディカル），抗MUC5AC抗体およびHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体（ThermoScientific）によりウェスタンブロットを行った．最終，ECLTMwesternblotdetectionreagent（GEHealthcare）に浸して反応させ，Filmに感光して現像した．4.MUC5ACELISA法96穴マイクロプレートに検量線用サンプルおよび被験薬を作用させたウサギ結膜組織培養上清液を添加し，固相化した．その後，Arguesoらの方法2）を参考に，抗MUC5AC抗体，HRP標識ヒツジ抗マウスIgG抗体（GEHealthcare）に続き，tetramethylbenzidine溶液（Sigma）と反応させた後，マイクロプレートリーダーにて波長450nmの吸光度を測定した．なお，検量線用サンプルとして，ウサギ結膜組織を24時間培養した上清液を1,000AU/mLとした2倍公比の希釈列サンプルを用いた．5.ウサギ結膜組織からのMUC5AC分泌量の測定ウサギより摘出した眼瞼結膜周囲の皮膚組織をハサミで切除し，結膜組織を広げ，4mm径トレパン（貝印）で打ち抜いて結膜組織片を作製した．BR中に，結膜組織片を入れ，5％CO2，37℃にて30分間安定化させた．被験溶液が入った48穴プレートに安定化させた組織片を入れ，5％CO2，37℃，90分間培養した．培養上清液中のMUC5AC量は，「4.MUC5ACELISA法」にて測定した．（109）あたらしい眼科Vol.28，No.2，20112636.統計解析EXSAS（アーム）を用いて，ジクアホソルの作用は，薬剤無添加群に対するDunnettの多重比較検定法，ヒアルロン酸ナトリウムの作用は，薬剤無添加群とのStudentのt検定法にて，5％を有意水準として解析した．II結果1.抗MUC5AC抗体の特異性抗MUC5AC抗体（Clone45M1）が反応する蛋白質の結膜組織での局在および蛋白質分子量分布を検討する目的で，ウサギ結膜組織をClone45M1抗体を用いた免疫染色，ウサギ結膜組織溶解液をウェスタンブロットにて解析した．図1に示すように，PAS染色（図1a）およびClone45M1抗体を用いた免疫染色（図1b）での陽性部位は，結膜の杯細胞中の粘液に認められた．また，陰性対照標本では，陽性部位が認められなかった（図1c）．図2に示すように，ウサギ結膜組織中で，Clone45M1抗体と反応する蛋白質の分子量は，250kDa以上であった．2.MUC5ACのELISA法の特異性本ELISA法における抗MUC5AC抗体（Clone45M1）の特異性について，ウサギ結膜組織培養上清液から調製した検量線用サンプルを用いて検討した（図3）．検量線用サンプル中のMUC5AC濃度に依存してELISA法における免疫反応および酵素基質反応により検出される吸光度（反応最終検出値）は上昇し，二者間に良好な相関性が認められた（相関係数＝0.99）．一方，抗MUC5AC抗体を反応させない場合は，高濃度のMUC5ACを含有しているサンプルにおいても，吸光度の上昇は認められなかった．3.ジクアホソルのウサギ結膜組織におけるMUC5AC分泌促進作用－ヒアルロン酸ナトリウムとの比較－図4に示すように，ジクアホソルの添加により培養時間90分の条件で，MUC5ACの分泌は濃度依存的に促進され，その作用は，10μM以上のジクアホソルで薬剤無添加群に比べて有意であった．一方，0.1％ヒアルロン酸ナトリウムabc図1結膜上皮組織のPAS染色および抗MUC5AC抗体による免疫染色像a：PAS染色．b：抗MUC5AC抗体（Clone45M1）による免疫染色．c：抗マウスIgG抗体による免疫染色（陰性対照）．○：抗MUC5AC抗体（＋）□：抗MUC5AC抗体（－）MUC5AC（AU/mL）吸光度（450nm）2.521.510.501101001,000図3ウサギ結膜組織由来MUC5ACと吸光度の回帰曲線各値は2例の平均値を示す．12kDa2501501007550図2ウサギ結膜組織中の抗MUC5AC抗体と親和性を示す蛋白質の分子量分布レーン1：マーカー，レーン2：ウサギ結膜組織溶解液．264あたらしい眼科Vol.28，No.2，2011（110）はまったく影響を及ぼさなかった．III考按今回，ウサギ結膜組織から分泌されるMUC5AC量を定量的に測定できるELISA法を確立した．ELISA法に用いた抗MUC5AC抗体（Clone45M1抗体）は，ウサギ結膜組織を用いた免疫染色の検討により，PAS陽性部位と同様にウサギ結膜上皮組織の杯細胞内糖蛋白質と結合し，結膜組織溶解液を用いたウェスタンブロットの検討により，250kDa以上の高分子蛋白質と特異的に結合することが明らかとなった．したがって，Clone45M1抗体は，ウサギ結膜組織内のMUC5ACに特異性が高いと考えられる．つぎに，本ELISA法の反応性を確認したところ，MUC5AC含有サンプルとELISA最終検出値間に良好な相関性が得られ，Clone45M1抗体を除く，他の要因による非特異的反応性も認められなかった．したがって，本ELISA法は，MUC5ACに特異性が高く，かつ定量評価可能であると考えられた．さらに，本ELISA法を用いて，ジクアホソルのMUC5AC分泌に対する作用を検討した結果，ジクアホソルは，ウサギ結膜組織からのMUC5ACの分泌を濃度依存的に促進し，その反応性は，10μM以上で薬剤無添加群に比べて有意であった．ジクアホソルのムチン分泌促進作用の反応は，ヒト結膜組織を用いたATPおよびUTPの反応性にほぼ類似しており7），ヒトとウサギ間の種差はほとんどないと考えられる．また，Fujiharaらは，ジクアホソルの点眼がウサギドライアイモデルにおける角膜上皮障害を改善することおよび本改善作用には，結膜上皮層からのPAS陽性蛋白質の分泌促進が関与している可能性を報告している8）．したがって，ジクアホソルは，MUC5ACの分泌促進作用を介してドライアイ患者に認められる涙液安定性の低下，ひいては涙液保持の低下などの眼表面の異常を正常化し，角結膜上皮障害の改善作用を示すと考えられる．ヒアルロン酸ナトリウムは，三次元的な網目構造を形成し，大量の水分を保持できることより眼表面での保水性10）およびフィブロネクチンとの結合を介した角膜上皮細胞の接着，伸展作用11）により，ドライアイ患者に対する治療効果も認められ12），角結膜上皮障害の治療薬として汎用されている．しかし，今回の結果からも明らかにされたが，ヒアルロン酸ナトリウムには，ムチン分泌を促進する作用が認められず，眼表面にムチンが被覆していないドライアイ患者では，満足した治療効果を得ることができない可能性が考えられる．今回，ジクアホソルが，ヒアルロン酸ナトリウムでは認められないウサギ結膜杯細胞からのMUC5ACの分泌を促進することを明らかにした．このことは，ジクアホソル点眼液が新規作用機序により，現在ヒアルロン酸ナトリウム点眼液では，効果不十分とされている症例に対しても有効性を示す可能性があり，新規のドライアイ治療薬としての効果が期待される．謝辞：本研究に協力いただきました堂田敦義博士，勝田修博士，篠宮克彦氏に深謝いたします．文献1）渡辺仁：ムチン層の障害とその治療．あたらしい眼科14：1647-1633,19972）ArguesoP,BalaramM,Spurr-MichaudSetal：DecreasedlevelsofthegobletcellmucinMUC5ACintearsofpatientswithSjogrensyndrome.InvestOphthalmolVisSci43：1004-1011,20023）DogruM,Asano-KatoN,TanakaMetal：OcularsurfaceandMUC5ACalterationsinatopicpatientswithcornealshieldulcers.CurEyeRes30：897-908,20054）横井則彦：ドライアイ．あたらしい眼科25：291-296,20085）ShigemitsuT,ShimizuY,IshiguroK：Mucinophthalmicsolutiontreatmentofdryeye.AdvExpMedBiol506：359-362,20026）ShimmuraS,OnoM,ShinozakiKetal：Sodiumhyaluronateeyedropsinthetreatmentofdryeyes.BrJOphthalmol79：1007-1011,19957）JumblattJE,JumblattMM：RegulationofocularmucinsecretionbyP2Y2nucleotidereceptorsinrabbitandhumanconjunctiva.ExpEyeRes67：341-346,19988）FujiharaT,MurakamiT,NaganoTetal：INS365suppresseslossofcornealepithelialintegritybysecretionofmucin-likeglycoproteininarabbitshort-termdryeyemodel.JOculPharmacolTher18：363-370,20020110MUC5AC（AU/mL）ジクアホソル（μM）1001,0000.1HA（％）＊＊＊＊＊NS4003002001000図4ウサギ結膜組織からのジクアホソルおよびヒアルロン酸ナトリウム（HA）のMUC5AC分泌に及ぼす影響各値は4例の平均値±標準誤差を示す．ジクアホソルおよびHAは，90分間反応させた．＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01，薬剤無添加（0μMジクアホソル）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．NS：有意差なし，薬剤無添加（0μMジクアホソル）群との比較（Studentのt検定）（111）あたらしい眼科Vol.28，No.2，20112659）FujiharaT,MurakamiT,FujitaHetal：ImprovementofcornealbarrierfunctionbytheP2Y（2）agonistINS365inaratdryeyemodel.InvestOphthalmolVisSci42：96-100,200110）NakamuraM,NishidaT,HikidaMetal：Combinedeffectsofhyaluronanandfibronectinoncornealepithelialwoundclosureofrabbitinvivo.CurrEyeRes13：385-388,199411）NakamuraM,HikidaM,NakanoTetal：Characterizationofwaterretentivepropertiesofhyaluronan.Cornea12：433-436,199312）YokoiN,KomuroA,NishidaKetal：Effectivenessofhyaluronanoncornealepithelialbarrierfunctionindryeye.BrJOphthalmol81：533-536,1997＊＊＊