《第51回日本白内障学会原著》あたらしい眼科30（1）：97.101，2013c糖尿病モデル動物OLETFラット水晶体におけるアミロイドbの蓄積長井紀章＊1竹田厚志＊1伊藤吉將＊1,2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所AccumulationofAmyloidbinLensofOtsukaLong-EvansTokushimaFattyRatNoriakiNagai1）,AtsushiTakeda1）andYoshimasaIto1,2）1）FacultyofPharmacy,2）PharmaceutialResearchandTechnologyInstitute,KinkiUniversity近年，糖尿病患者では非糖尿病患者と比較し，アミロイドb（Ab）の主要臓器での蓄積が高いことが報告され，Abと糖尿病の関連性が注目されている．そこで今回，自然発症型糖尿病モデル動物であるOtsukaLong-EvansTokushimaFatty（OLETF）ラットを用い，糖尿病発症における水晶体中アミロイドb1-42（Ab1-42）の蓄積について検討を行った．糖尿病発症前の10週齢では，OLETFと正常ラット（LETOラット）間で水晶体中におけるAb1-42量で差はみられなかったが，糖尿病を伴う60週齢OLETFラット水晶体では，LETOラットと比較しAb1-42の蓄積が有意に高かった．また，Ab産生に関わる遺伝子〔amyloidprecursorprotein（APP），b-siteAPP-cleavingenzymeおよびpresenilin〕発現の増加もOLETFラットではLETOラットに比べ有意に高値を示した．さらに，60週齢のOLETFラットでは軽度な水晶体混濁度がみられ，この混濁と水晶体中Ab1-42の蓄積には強い相関が認められた．これらの結果は，Abが糖尿病眼疾患の病態に深く関わるというこれまでの報告を支持した．Recently,itwasreportedthatthelevelofamyloidbpeptide（Ab）intheeyesofdiabetichumanswashigherthanintheeyesofnormalhuman（non-diabetic）,andthatAbwasimplicatedinthesecondarycomplicationsofdiabetesmellitus.Inthispresentstudy,wedeterminedtheexpressionofAb1-42inthediabetesmellituslens,usingthespontaneousdiabetesmellitusOtsukaLong-EvansTokushimaFatty（OLETF）rats.TheAblevelsdidnotdifferbetween10-week-oldnormalcontrolratsandOLETFratswithoutdiabetesmellitus.However,theAblevelsinthelensesof60-week-oldOLETFratswithdiabetesmellitusweresignificantlyhigherthanin60-week-oldnormalcontrols.Furthermore,thegeneexpressionlevelscausingAbproduction〔amyloidprecursorprotein（APP）,b-site-APPcleavingenzymeandpresenilin〕inthelensesofOLETFratswerealsosignificantlyhigherthaninLETOrats.Inaddition,acloserelationshipwasobservedbetweenAb1-42levelsandlensopacification.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）30（1）：97.101,2013〕Keywords：アミロイドb，水晶体，糖尿病，OtsukaLong-EvansTokushimaFattyラット，白内障．amyloidb,lens,diabetesmellitus,OtsukaLong-EvansTokushimaFattyrats,cataract.はじめにアミロイドb（Ab）とは高齢者痴呆疾患の一つであるアルツハイマー病（Alzheimer’sdisease：AD）の原因物質として知られている．近年，このAD患者の眼領域において網膜機能の低下，網膜神経節細胞の減少および視神経変性が高率に認められている1.3）．さらに，糖尿病患者では非糖尿病患者と比較し，細胞傷害性を示すAbの蓄積が高く，糖尿病網膜症患者の硝子体液中のAbの著明な低下およびタウ蛋白質の上昇が報告されている2）．このような変化はAD患者脳脊髄液中の変動と類似しており，眼疾患とADの間に共通の病態発症機序が存在し，特にAbが眼疾患の病態に深く関わっている可能性を示唆している．また，水晶体領域においても，AD患者やDown症候群患者の水晶体中でAbが蓄積することが報告され，Abと白内障の関係が注目されている4,5）．〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/13/\100/頁/JCOPY（97）97 しかしながら，これらADと水晶体中Abの関連については多数報告がある4,5）が，糖尿病発症と水晶体中Ab蓄積の関与についての報告はほとんどなく，これら糖尿病発症時における水晶体中Abの変化を検討することは非常に重要と考えられる．OtsukaLong-EvansTokushimaFatty（OLETF）ラットは大塚製薬株式会社が開発したII型糖尿病モデルである．このOLETFラットは，10週齢程度からグルコースに対する特異的なインスリン分泌不全や末梢組織におけるインスリン抵抗性が認められ，25週齢の経口ブドウ糖負荷試験ではほぼ全例がメタボリックシンドロームおよび高インスリン血症を伴うII型糖尿病と診断される6）．60週齢以後では，膵臓Langerhans島は萎縮・消失しており，インスリン顆粒を認める膵b細胞数が極端に減少し，最終的に低インスリン血症となる糖尿病モデルラットであり，これらOLETFの生物学的性質の変化は，ヒトのII型糖尿病と一致することが知られている6）．また，このOLETFラットは20週齢では綺麗な水晶体組織であるが，40週齢でソルビトールの水晶体蓄積と組織の崩れが観察され，60週齢では組織崩壊の拡大と混濁が生じる7）ことから，自然発症型の糖尿病性白内障モデルとして使用できるものと考えられている．本研究では，このOLETFラットを用い糖尿病発症時における水晶体中Abの蓄積について検討を行った．I対象および方法1.実験動物実験には大塚製薬株式会社徳島研究所から供与された10および60週齢雄性Long-EvansTokushimaOtsukaラット（LETOラット，正常ラット）とOLETFラットを用いた．これらラットは25℃に保たれた環境下で飼育し，飼料（飼育繁殖固形飼料CE-2，日本クレア社）および水は自由に摂取させた．動物実験は近畿大学実験動物規定に従い行った．2.ラット血中グルコース，トリグリセリド，コレステロールおよびインスリン値の測定血中グルコース（Glu）およびトリグリセリド（TG）はロシュ社製AccutrendGCTにより測定し，コレステロール（Cho），インスリン測定には和光純薬工業社製CholesterolE-Testキットおよび森永生科学研究所製ELISAInsulinキットをそれぞれ用いた．3.ラット水晶体中Ab1.42値の測定LETO，OLETFラットの水晶体を生理食塩水600μl中にてホモジナイズし，その懸濁溶液を測定に用いた．Ab量測定にはHuman/RatbAmyloid（42）ELISAKit（和光純薬工業社製）およびマイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）を用い450nmで吸光度を測定した．4.PCR（polymerasechainreaction）法による遺伝子発現の確認摘出した水晶体よりAcidGuanidium-Phenol-Chloroform法により全RNAを抽出し，TaKaRaRNAPCRKitおよびPCR装置（MasterCycler，エッペンドルフ社製）を用い1mgの全RNAからcDNAを合成した．合成したcDNAにGenBankTMからのデータベースより設計した各遺伝子特異的プライマーを加え，MasterCyclerを用いた半定量PCR法またはLightCycler（ロシュ社製）を用いたreal-timePCR法により遺伝子発現量の測定を行った．以下に半定量PCR法で用いた遺伝子特異的プライマー（SIGMA社製）およびPCR条件を示す．Neprilysin（NEP）：Forword5￠-GAGACCTCGTTGACTGGTGGACTCA-3￠；Reverse5￠-TGAGTTCTTGCGGCAATGAAAGGCA-3￠，endothelinconvertingenzyme（ECE-1）：Forword5￠-AGAACATAGCCAGCGAGATCATCCTG-3￠；Reverse5￠-TGCTGTACCATGCACTCGGTCTGCTG-3￠，damage-inducedneuronalendopeptidase（DINE）：Forword5￠-AATTCCTCAAACTGGGACACGCTACC-3￠；Reverse5￠-TGTCTGTCAAGAAGATCCGACAGGAGG-3￠，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）：Forword5￠-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCTAC-3￠；Reverse5￠-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCACC-3￠．PCR条件は，30cycleでdenaturation（94℃，30s），annealing（NEP，ECE-1，DINE75℃，GAPDH59℃，30s），extension（72℃，1min）で行った．この増幅された試料は1.5％アガロースゲルを用いた電気泳動（100V，40min）にて検出を行い，カメラにて撮影した．また，表1には今回real-timePCR法（SYBRGreen）で使用したアミロイド前駆体蛋白質（APP），a-セクレターゼ（adisintegrinandmetalloprotease10：ADAM10），b-セクレターゼ（b-siteAPP-cleavingenzyme1：BACE1）お表1Real.timePCR法におけるプライマー塩基配列PrimerSequence（5￠-3￠）APPFORREVGGATGCGGAGTTCGGACATGGTTCTGCATCTGCTCAAAGADAM10FORREVGCACCTGTGCCAGCTCTGATTCCGACCATTGAACTGCTTGTBACE1FORREVCATTGCTGCCATCACTGAATCAGTGCCTCAGTCTGGTTGAPS1FORREVCATTCACAGAAGACACCGAGATCCAGATCAGGAGTGCAACCPS2FORREVCTTCACCGAGGACACACCCTGACAGCCAGGAACAGTGTGGGAPDHFORREVACGGCACAGTCAAGGCTGAGACGCTCCTGGAAGATGGTGATAPP：Amyloidprecursorprotein，FOR：Forword，REV：Reverse．98あたらしい眼科Vol.30，No.1，2013（98） よびg-セクレターゼ（presenilin1,2：PS1,2）の各種プライマー塩基配列（SIGMA社製）を示した．Real-timePCR法の測定条件は以下のとおりで行った．Denaturing（95℃，10秒），annealing（63℃，10秒），extension（72℃，5秒）．本研究ではGAPDHをハウスキーピング遺伝子とし，各種遺伝子発現量はGAPDHに対する比から求めた．5.前眼部画像撮影および解析前眼部画像撮影約5分前に0.1％ジピベフリンをラット両眼に点眼し散瞳させた．ラットの前眼部画像は無麻酔下で，前眼部画像解析装置EAS-1000（ニデック社）により撮影した．さらに得られたスリット像はEAS-1000付属の解析プログラムにより水晶体混濁の数値化を行った．6.統計解析データは，平均±標準誤差として表した．有意差はStudent’st-testにて解析し，0.05未満のp値を有意な差として示した．II結果1.糖尿病発症時におけるAb産生に関わる遺伝子発現量の変化図1にはLETOおよびOLETFラットの体重および糖尿病関連血液検査値を示す．10週齢のOLETFラットではLETOラットに比べ体重およびGlu値が若干高値を示したが，TG，Choおよびインスリン値には差がみられなかった．一方，60週齢では，血中Glu，TGおよびCho値はLETOラットと比較しOLETFラットで有意に高値であったが，体Bodyweight重およびインスリン値は低値を示した．図2に摘出水晶体中のAb産生に関わる遺伝子であるAPP，ADAM10，BACE1，PS1および2のmRNA発現量を示した．Ab産生促進に関わる遺伝子APP，BACE1，PS1および2ではLETOラットと比較しOLETFラットでそれぞれ1.68，1.56，1.40，1.83倍高値であった．なかでもAPPとPS2はLETOラットのそれと比較し有意に高かった．一方，Abの蓄積抑制に関わる遺伝子であるADAM10ではOLETFラット水晶体での発現量はLETOラットの1.2倍とわずかに高かったものの有意な差はみられなかった．2.OLETFラット水晶体におけるAb1.42の蓄積と水晶体混濁との関連性図3には10および60週齢LETOとOLETFラット水晶体中Ab1-42量を示す．これら10週齢ではLETOラットとOLETFラット間で水晶体中のAb1-42量に差はみられなかったが，糖尿病を伴う60週齢のOLETFラット水晶体では，LETOラットと比較し有意に高いAb1-42量が認められた．図4には10および60週齢のLETOとOLETFラット水晶体中におけるAb分解・除去に関わるNEP，ECE-1，DINE遺伝子発現について示す．LETOおよびOLETFラットともに，NEP，ECE-1の遺伝子発現は認められたが，DINEの遺伝子発現はみられなかった．図5には60週齢OLETFラット水晶体中Ab1-42量と水晶体混濁度の関連性を示す．60週齢OLETFラット水晶体では軽度の白濁が確認できた．また，これら水晶体混濁とAb1-42量とで強い相関が認められた（p＜0.05）．GluTGTG（mg/dl）：LETO■：OLETF＊00010week60week10week60week10week60weekChoInsulin：LETO：LETO120300：LETO400■：OLETF＊Glu（mg/dl）：LETO■：OLETF＊10040500280240Bodyweight（g）4003202001601203002402001608080＊■：OLETFInsulin（ng/dl）＊■：OLETF10080604020250Cho（mg/dl）200150100500010week60week10week60week図1LETOおよびOLETFラットにおける体重と糖尿病関連血液検査値平均値±標準誤差．n＝6．＊p＜0.05vs.各項目におけるLETOラット．（99）あたらしい眼科Vol.30，No.1，201399 APPADAM10BACE13025108765＊：LETO■：OLETFADAM1/GAPDH（×10－2）：LETO■：OLETFBASE1/GAPDH（×10－4）：LETO■：OLETFAPP/GAPDH（×10－3）2015105432106420010week60week10week60week10week60weekPS1PS2PS1/GAPDH（×10－4）121086420：LETO■：OLETF0＊：LETO■：OLETF10week60week10week60weekPS2/GAPDH（×10－3）108642図2Real.timePCR法を用いたLETOおよびOLETFラットにおけるAb産生関連遺伝子発現量の変化平均値±標準誤差．n＝5.6．＊p＜0.05vs.各項目におけるLETOラット．12LETOOLETF＊Ab1-42（fmol/mgprotein）10NEP86ECE-142DINE010week60week図3糖尿病発症に伴うラット水晶体中Ab1.42の蓄積GAPDH平均値±標準誤差．n＝5.6．＊p＜0.05vs.各項目におけるLETOラット．図4半定量PCR法による60週齢OLETFラット水晶体16におけるAb分解に関わる遺伝子発現の確認y＝0.0048x＋5.8974r＝0.81146Ab1-42（fmol/mgprotein）1412III考按108今回用いたOLETFラットは，10週齢ではLETOラットと比較し，体重およびGlu値がわずかに高かったが，TG，Choおよびインスリン値には差がみられず，糖尿病未発症な2状態であった．一方，60週齢のOLETFラットでは低イン0スリン血症を伴う高血糖を示した（図1）．この結果は，これOpacity（pixels）まで報告されている60週齢以後のOLETFラットでは膵臓05001,0001,5002,000図560週齢OLETFラット水晶体中Ab1.42量と水晶体Langerhans島が萎縮・消失し低インスリン血症を伴った高混濁の関連性血糖がみられるというII型糖尿病モデルの特性と一致しており，本研究で用いたOLETFラットがこれまでの報告と同様II型糖尿病発症とその進行が起こっていることを示した．100あたらしい眼科Vol.30，No.1，2013（100） そこで本研究では，糖尿病発症前の10週齢およびII型糖尿病が十分に進行した60週齢のOLETFラットを用い，糖尿病発症と水晶体中Abの蓄積について比較検討を行った．Abはアミロイド前駆体蛋白質（APP）が酵素により切断されることにより産生する40あるいは42残基のアミノ酸から成るペプチドであり，これら切断酵素として細胞膜から28番目のアミノ酸残基外側で細胞外ドメインを切断するbセクレターゼ（b-siteAPP-cleavingenzyme1）および膜貫通部で切断を行うg-セクレターゼ（presenilin1,2）が知られている．この40あるいは42残基アミノ酸ペプチドはそれぞれAb1-40，Ab1-42とよばれ，まずAb1-42が核となりAb1-40が凝集し線維形成を行うことから，Ab1-42のほうがAb1-40よりも凝集しやすいことが報告されている8）．一方，Abはヒトの正常な網膜組織においてはこれまでに検出されていない．この理由としては，通常の細胞では細胞膜から12アミノ酸外側で細胞外ドメインを切断するa-セクレターゼが存在し，Abの過剰産生が抑えられているためである9）．また，正常な組織においてはAbの分解酵素であるneprilysin（NEP），endothelinconvertingenzyme（ECE）またはdamage-inducedneuronalendopeptidase（DINE）によりAbは蓄積することなく分解・除去される10）．そこで今回，糖尿病発症時における60週齢OLETFラット水晶体のAPP，ADAM10，BACE1，PSについての遺伝子発現量を検討した．その結果，Ab産生促進に関わる遺伝子APP，BASE1，PS1および2ではLETOラットと比較しOLETFラットでそれぞれ高値であり，なかでもAPPとPS2はLETOラットのそれと比較し有意に高かったが，Abの蓄積抑制に関わる遺伝子ADAM10のOLETFラット水晶体での発現量は，LETOラットの1.2倍とわずかに高かったものの有意な差はみられなかった（図2）．また，凝集能の高いAb1-42についても測定を行った．10週齢のOLETFラット水晶体では，LETOラットと比較しAb1-42量に差はみられなかったが，60週齢OLETFラット水晶体ではLETOラットのそれと比較しAb1-42が有意に高値を示した（図3）．一方，これらLETOおよびOLETFラット水晶体ではともに，NEPおよびECE-1の遺伝子発現はみられたが，DINEは検出されず，LETOとOLETFラットでその発現に大きな差はみられなかった（図4）．Wistarラット水晶体でNEP，ECE-1およびDINEmRNA発現を検討したところ，いずれの遺伝子発現も確認できたことから（Datanotshown），これらLongEvans種のラット水晶体ではAbが蓄積しやすい可能性が示唆された．さらに，60週齢OLETFラット水晶体では軽度の白濁が認められ，これら水晶体混濁とAb1-42量とで強い相関が認められた（図5）．水晶体でのAb蓄積は水晶体混濁をひき起こすことはGoldsteinら4,5）によりすでに報告されている．これらの本結果および報告から，OLETFラット糖尿病発症時には水晶体中でAb産生促進に関わる遺伝子発現量の増加がみられ，これによりAb1-42の水晶体蓄積および白濁が起こる可能性が示唆された．以上，本研究では自然発症の糖尿病モデル動物OLETFラット水晶体において，糖尿病発症時にAb1-42蓄積が増加することを明らかとした．さらに，OLETFラット糖尿病発症時の水晶体では，Ab産生促進に関わる遺伝子発現量の増加が起こる可能性を示した．これら自然発症の糖尿病モデル動物を用いた糖尿病とAb産生についての研究報告はなく，本モデル動物および研究結果はこれからのAbと白内障の関係を研究するうえできわめて有用であると考えられる．今後Ab1-42や抗Ab抗体またはAbの凝集を抑制するCongoredを眼球内の硝子体内へ投与することにより，水晶体混濁度がどのように変化するのかについて検討を進めていく予定である．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）YonedaS,HaraH,HirataAetal：Vitreousfluidlevelsofbeta-amyloid（（1-42））andtauinpatientswithretinaldiseases.JpnJOphthalmol49：106-108,20052）HaraH,Oh-hashiK,YonedaSetal：Elevatedneprilysinactivityinvitreousofpatientswithproliferativediabeticretinopathy.MolVis12：977-982,20063）NingA,CuiJ,ToEetal：Amyloid-betadepositsleadtoretinaldegenerationinamousemodelofAlzheimerdisease.InvestOphthalmolVisSci49：5136-5143,20084）GoldsteinLE,MuffatJA,ChernyRAetal：Cytosolicbeta-amyloiddepositionandsupranuclearcataractsinlensesfrompeoplewithAlzheimer’sdisease.Lancet361：1258-1265,20035）MoncasterJA,PinedaR,MoirRDetal：Alzheimer’sdiseaseamyloid-betalinkslensandbrainpathologyinDownsyndrome.PLoSOne5：e10659,20106）YamadaA：Alterationofelectroetinograminspontaneouslydiabeticrats：effectofcaloricrestriction.JJuzenMedSoc110：418-442,20017）KuboE,MaekawaK,TanimotoTetal：BiochemicalandmorphologicalchangesduringdevelopmentofsugarcataractinOtsukaLong-EvansTokushimafatty（OLETF）rat.ExpEyeRes73：375-381,20018）JarretJT,LansburyJrPT：Seeding“one-dimensionalcrystallization”ofamyloid：apathogenicmechanisminAlzheimer’sdiseaseandscrapie?Cell73：1055-1058,19939）KukarTL,LaddTB,BannMAetal：Substrate-targetinggamma-secretasemodulators.Nature453：925-929,200810）SelkoeDJ：Amyloidbeta-proteinandthegeneticsofAlzheimer’sdisease.JBiolChem271：18295-18298,1996（101）あたらしい眼科Vol.30，No.1，2013101